基于纳米金增强效应新型生物传感方法构建及其在食源性致病菌毒力基因及miRNAs检测的应用

发布时间：2020-03-25 18:53

【摘要】：保障食品安全和维护人类健康是当前热门的两个话题,其中食源性致病菌污染导致食品安全事件频发,严重影响了我国经济正常发展和公众健康,因此建立高灵敏检测方法是降低食源性致病菌污染风险和预防感染的迫切需要。食源性致病菌毒力基因可提供致病菌毒性以及特定的遗传信息,识别致病性基因是识别样品中食源性致病菌污染的重要环节。本研究拟以食源性致病菌毒力基因和miRNAs为对象,纳米金为基础,制备不同形貌和性能的金纳米材料及其组装体,通过表面修饰使其具有良好的生物相容性,借助其特殊的光学效应以及良好的导电性,构建一系列光学信号增强或者电信号增强的纳米核酸传感器,建立简单、安全、可视化的生物传感检测新方法,用于快速灵敏地检测食源性致病菌毒力基因,并实现胞内毒性生物标志物miRNAs高灵敏检测及可视化,为实现食源性致病菌快速检测以及胞内miRNAs的高效识别奠定基础;基于宿主细胞内miRNAs的表达量与食源性致病菌污染剂量的关系,也为建立以敏感细胞为模型早期筛查食品中潜在致病菌的方法提供新的思路。1.不同纵横比的金银核壳纳米棒(Gold@silver nanorods,Au@Ag NRs)的可控合成。采用种子生长法制备了不同纵横比的Au@Ag NRs,确定合成过程中硝酸银、抗坏血酸和金纳米棒的最佳加入量。通过调控pH值,结合紫外可见光光谱仪、透射电子显微镜、X射线衍射仪探讨Au@Ag NRs的生长机理。数据结果显示pH值调控表面活性剂CTAB吸附在金纳米棒(Gold nanorods,AuNRs)晶面的位置和速率,从而调控Ag~0吸附在AuNRs表面的位置,由此制备了不同大小和形状的Au@Ag NRs,为下一阶段利用Au@Ag NRs物理化学性质构建生物传感器奠定基础。2.基于金银核壳纳米棒表面增强荧光(Surface enhanced fluorescence,SEF)传感器的构建。以不同纵横比的金纳米棒为核制备Au@Ag NRs,通过对Au@Ag NRs表面修饰茎环探针和荧光团分子Cy3,构建Au@Ag NRs表面增强荧光的“ON-OFF”核酸传感器,实现荧光检测大肠杆菌O157:H7毒力基因eae A。对影响传感器中荧光团分子Cy3荧光强度的因素进行考察发现,当选择金银核壳纳米长棒,Cy3分子与Au@Ag NRs表面之间的距离为10 nm时,Au@Ag NRs表面增强荧光团分子Cy3的荧光强度效果最强,有利于提高检测的灵敏度。当eae A基因浓度在1×10~(-17)-1×10~(-11) mol/L之间时,Cy3荧光团分子的荧光强度与大肠杆菌O157:H7基因eae A浓度的对数值呈线性关系,线性回归方程为y=95.97 x+1992(R~2=0.9947),最低检出限为3.33×10~-1818 mol/L。构建的荧光增强核酸传感器也表现出良好的特异性和重复性,可以区分碱基错配序列,回收率在98.36%-101.67%之间。3.基于金纳米十字@二硫化钼(Gold nanocrosses@molybdenum disulfide,AuNCs@MoS_2)异源二聚体增强电化学信号便携式传感器的构建。为进一步实现快速、灵敏、现场检测食源性致病菌,将AuNCs@MoS_2异源二聚体修饰在丝网印刷电极(Screen printed electrode,SPE)上,建立了便携式电化学传感器检测大肠杆菌O157:H7毒力基因eae A。目的基因eae A引发由toehold介导的DNA链置换反应获得双链DNA H_1/H_2,该双链DNA与AuNCs@MoS_2/SPE上的cDNA结合,在[Ru(NH_3)_6]~(3+)分子存在的情况下,引起电化学信号变化,从而实现目标物的定量检测。通过toehold介导的DNA链置换反应、选择AuNCs@MoS_2修饰电极表面增强电化学信号,大大提高了检测的灵敏度,当eae A浓度在1-10~5 amol/L之间时,其与电流的差值呈线性相关,线性方程为ΔI(μA)=1.61 log[C_(eae A)(amol/L)]+2.02(R~2=0.9974),最低检出限为0.096 amol/L。构建的传感器特异性良好,可以区分单碱基错配序列。4.基于金纳米棒-金纳米十字(Gold nanorod-gold nanocross,AuNR-AuNC)“FRET-SEF”荧光信号增强检测miRNAs探针的构建及其胞内成像。为实现胞内毒性评价这一目标,进一步构建了新型一对一组装的AuNR-AuNC二聚体“FRET-SEF”核酸探针,以“OFF-enhanced ON”荧光增强开关检测胞外胞内生物标志物miRNAs。AuNC与Cy5荧光团分子之间10 nm的距离,有利于AuNC表面增强Cy5的荧光强度,AuNC与AuNR的侧面组装,有利于AuNR对Cy5分子的荧光共振能量转移,将AuNC与AuNR巧妙结合构建AuNR-AuNC二聚体,充分利用二聚体产生的荧光增强效应,大大提高了检测的灵敏度。当miRNA-21的浓度分别在0.0006-0.0016 fmol/L和0.1-100 fmol/L范围内时,线性方程分别为F=1830.32 logC+6349.27(R~2=0.9901)和F=244.41 logC+1916.10(R~2=0.9984),检出限可达0.5 amol/L和0.03 fmol/L,由此证明构建的AuNR-AuNC二聚体探针可精确测定生物标志物miRNA。此外,构建的AuNR-AuNC二聚体探针具有较好的稳定性和低毒性,实现了胞内检测Hep G2细胞生物标志物miRNA-21,构建的AuNR-AuNC二聚体探针也初步实现了以敏感细胞为模型评价食源性致病菌毒力因子等外源危害的毒性水平。5.基于FDTD Solutions模拟及金纳米花@石墨烯量子点(Gold nanoflower@graphene quantum dots,AuNF@GQDs)构建彗星式异源二聚体增敏探针实现miRNA-34a的检测和体内成像。为实现体内毒性评价,构建了低毒性彗星式异源二聚体AuNF@GQDs增敏探针,以toehold诱导目标链miRNA引发的从荧光信号FRET“off”到DNA循环“on”模式的DNA增敏链置换反应,识别体内体外miRNA-34a的表达量,评估细胞的老化程度。根据FDTD Solutions计算模拟AuNF与GQDs之间距离为4 nm时,AuNF对GQDs有很强的FRET效应,可缩短响应时间,增强消光效率,有利于提高检测的灵敏度。MiRNA-34a浓度在0.4-4 fmol/L时,线性方程为Y=1963 x+213,R~2=0.9921,检出限为0.1 fmol/L,且该探针特异性好,可以区分一个碱基错配序列。该低毒性探针同样也应用于生长因子TGF-β1诱导后的大鼠心肌细胞(H9C2)原位成像和检测miRNA-34a的表达量,当TGF-β1浓度在5-500 ng/mL之间时,胞内荧光强度与TGF-β1浓度的对数值呈线性相关,线性方程为y=1.37 x+1.04,R~2=0.9330。此外,构建的二聚体AuNF@GQDs增敏探针注射入12月龄的C57BL/6J小鼠左心室中体内检测miRNA-34a,成功用于评价小鼠心脏的老化程度,且该探针对小鼠没有负面毒性效应。总之,本论文构建的具有各向异性的金银核壳纳米棒以及纳米二聚体增强型核酸探针,通过设计探针的形貌和空间分布,发现荧光和电化学增强机制,应用于食源性致病菌毒力基因的高灵敏检测,对建立通过监测食源性致病菌浸染体内引起效应生物标志物表达水平的变化,从而评估食源性致病菌的毒性和宿主受感染的程度具有重要意义。
【图文】：

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图 1-2 聚合酶链式扩增反应（PCR）原理图Fig.1-2 Outline of the processes involved in the polymerase chain reaction (PCR)由于 PCR 构建的方法需要设计待测致病菌对应的探针，，同时标记同位素以及荧光昂贵，为使这些缺点最小化，需要开发新型的成本可控且响应迅速的检测方法，并

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图 1-3 构建选择性识别致病菌纳米探针原理图atic representation showing the fabrication of recognition elements o病菌及其毒力基因检测的纳米材料通常包括金纳Ps）、金纳米棒（Gold nanorods，AuNRs）、磁纳米
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS207.4;TP212;O657.1

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