便携式生物传感器的构建及其在核酸现场检测中的应用

发布时间：2020-03-28 14:39

【摘要】：癌症,即恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康与寿命,是疾病死亡的重要原因,而相关癌症标志物的快速、准确检测为癌症的早期诊断提供了重要的方法和思路。核酸标志物(DNA和RNA)是当前体外诊断的主要目标分子之一。传统的核酸检测方法包括微阵列法、PCR法、原位杂交法等,虽然这些方法能实现目标核酸的准确检测,但其需要精密昂贵的仪器,专业的操作人员,复杂的操作步骤等,限制了其在现场检测中的应用。因此,设计与开发便携式生物传感器并用于核酸的现场检测是非常必要的,在疾病诊断和临床应用中具有重要的意义。本论文致力于核酸现场检测新方法的开发研究,通过利用简单易得的材料、便携式分析仪等,构建了以下几种便携式生物传感器:1.在棉线上构建了基于温度动态响应的超亲水-疏水图案,并以此为基础构建了便携式核酸传感器用于DNA的现场检测。在该传感器中,利用形态随温度变化的液体蜡在棉线上构建了超亲水-疏水图案,使检测区被控制在一个较窄的区域,使得检测信号更加集中,从而提高检测性能。通过金纳米颗粒在检测区的聚集,实现了目标DNA的可视化及定量检测,其检测限可达0.75 nM。另外,该基于棉线的核酸传感器相比于传统的侧流层析试纸,其所需试样量更少且流速更快,可以缩短检测时间。该传感器具有简单、价格低廉、检测快等优点,在提升发展中国家的健康服务方面具有巨大的潜力。2.以生物矿化为灵感,合成了DNA-Cu3(PO4)2杂化纳米花,合成的杂化纳米花具有高稳定性、高比表面以及强DNA封装能力。并以DNA-Cu3(PO4)2杂化纳米花为主要组成部分构建了microRNA(miRNA)传感平台,该传感平台以DNA-Cu3(PO4)2杂化纳米花为捕获剂、棉线为微流控通道以及血糖仪为信号输出设备。该传感器可实现miRNA-21的定量检测,其检测限为0.41 nM。此外,该传感器具有良好的抗干扰能力,可用于细胞裂解液中miRNA的检测。为miRNA的现场快速检测及临床应用提供了重要的手段。3.构建了三维DNA纳米机器,并以荧光信号和血糖仪信号为输出信号,实现了miRNA的双模式检测。该DNA纳米机器的主体为磁珠,在其上修饰了大量的发夹探针BHQ-H1-FAM作为DNA轨道分子,miRNA-21作为催化链并激活该三维DNA纳米机器,蔗糖酶-H2复合物则作为辅助链,通过链取代反应使纳米机器连续运行。当存在目标miRNA-21时,H1中的荧光恢复,产生荧光信号,蔗糖酶通过H2被引入磁珠表面,通过磁分离将其从溶液中分离,分离的蔗糖酶可催化水解蔗糖为葡萄糖,并用便携式血糖仪进行定量。该传感器具有高灵敏度及良好的特异性,对于荧光信号及血糖仪信号,其检测限分别为98 pM及60 pM。相比于单模式检测,该三维DNA纳米机器拥有独特的双信号输出,其结果更为可信,且可满足实验室及现场检测的不同需求,在疾病诊断及临床应用方面具有巨大的潜力。4.利用二氧化钛的自清洁性能,构建了以二氧化钛为基底的可再生超浸润生物芯片用于miRNA-141的特异性及定量检测。通过水热法在氟掺杂氧化锡(FTO)导电玻璃表面合成了二氧化钛纳米线阵列,并在其上构建了超亲水-超疏水图案,由于超亲水微井与超疏水基底浸润性的差别,分析物易浓缩富集于超亲水微井中,实现了miRNA的灵敏检测。此外,由于二氧化钛的光催化性能,该超浸润生物芯片可通过紫外光照射使其表面的有机物发生降解,从而实现再生。该再生的基底可重新用于miRNA传感器的构建,且在多个循环中得到了一致的检测结果。该研究为可再生生物芯片的构建提供了新思路、新方法,并在生物医学诊断方面具有潜在的应用价值。
【图文】：

作用机制,聚合酶,碱基

ＭｉＲＮＡ是一类内源性非编码的小分子ＲＮＡ，其长度约为１８－２５个碱基，逡逑广泛存在于动植物及病毒中，在基因的表达中发挥着重要的调节作用。逡逑ｍｉＲＮＡ的合成及作用机制是一个十分复杂的生理过程［９＿１１］。如图２－１所示，逡逑首先，ｍｉＲＮＡ在ＲＮＡ聚合酶ＩＩ或ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ的作用下转录成初级ｍｉＲＮＡ逡逑（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ），随后在细胞核内通过核酸内切酶Ｄｒｏｓｈａ的作用形成长度约为逡逑７０个碱基的儢环结构，称为前体ｍｉＲＮＡ邋（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ在细胞逡逑－３邋－逡逑

试纸,侧流,层析

图２－２侧流层析试纸的组成及结构。逡逑侧流层析试纸最常见的检测原理有两种：三明治结构检测原理和竞争检逡逑测原理［４８］。逡逑（１）三明治结构检测原理逡逑三明治结构检测原理一般用于待测目标物拥有多于一个结合位点的情逡逑况，以抗原为例，该检测形式原理如图２－３Ａ所示，在该检测过程中用到了三逡逑种不同的检测抗体。能识别目标抗原的抗体１邋（Ａｂ0首先与标记物（ｌａｂｅｌ）逡逑相结合并固定在层析试纸的结合垫上。当试样溶液加到试样垫后，在毛细作逡逑用下，样品迅速浸透结合垫，使ｌａｂｄ－Ａｂ１复合物重新水化，并随着试样溶液逡逑沿吸水垫方向移动，若样品中存在待测抗原Ａｇ，其就会与ｌａｂｅｌ－Ａｂｉ复合物逡逑相结合，形成ｌａｂｅｌ－Ａｂ＾Ａｇ复合物。随后，试样溶液通过固相化有捕获抗体２逡逑（Ａｂ２）的检测线时，由于Ａｂ２与Ａｂ邋１能识别同一抗原的不同位点，，ｌａｂｅｌ－Ａｂ邋１邋－Ａｇ逡逑被检测线上的Ａｂ２捕获，形成Ｉａｂｅｌ－Ａｂｉ－Ａｇ－Ａｂ２三明治夹心式的复合体。使逡逑
【学位授予单位】：北京科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657;TP212.3

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