基于目标物介导等温酶放大的新型光学生物传感器研究

发布时间：2020-05-29 14:18

【摘要】：近年来,研究人员不断发展能够早期诊断人类疾病或检测食品、环境中有害物质的高灵敏生物传感技术。当极低浓度的疾病标志物或食品污染物存在时,单纯基于受体-配体相互作用的传统生物传感方法通常不够灵敏,难以满足早期预警的要求。因此,核酸等温酶扩增技术的发展对超灵敏生物传感器的构建及其在现代生物学、生物医学及食品安全等领域中的应用具有重要意义。滚环扩增技术(RCA)作为等温酶放大技术中应用最广泛的一类,具有高效性及快速反应动力学的特点,通过信号的指数倍扩增提高检测灵敏度。本论文以核酸作为生物识别元件,以疾病标志物和食品安全污染物作为检测目标物,将滚环扩增技术及其他信号放大策略与荧光分析法相结合,构建了三种快速、高精度、超灵敏的新型光学生物传感器,分别用于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)与赭曲霉毒素A(OTA)的检测。本研究论文的主要内容由以下三部分组成:第一,基于目标物介导内切酶辅助滚环扩增策略,构建了一种新型的荧光生物传感器,用于UDG活性检测。目标物UDG能够特异性移除核酸探针上的碱基U并产生能够被核酸内切酶IV特异性切割的无嘌呤无嘧啶位点(AP位点),进而生成引物链用于启动滚环扩增反应。标有AP位点的分子信标能够与RCA产物结合,使核酸内切酶IV能够特异性识别AP位点并断裂,释放荧光基团,从而实现了对UDG活性的超灵敏、高特异性检测。该方法中多功能发夹型探针经过特殊设计,不仅可以作为核酸探针与目标物UDG特异性识别,而且可通过碱基切除修复通路产生大量的RCA引物,启动了聚合-剪切的循环放大反应。在最优的实验条件下,该荧光传感器的最低检测限为9.3×10~(-5)U mL~(-1),检测范围达5个数量级,实现了UDG活性的超灵敏检测。同时,该方法能够有效避免非特异性荧光信号的产生。另外,通过重新设计核酸探针的序列,该方法还可用于其他目标糖基化酶的超灵敏、高精度检测。第二,以UDG作为模式分析物,构建了一种基于修复酶辅助引物重塑扩增的快速指数倍扩增策略。将环状模板(CT)分别与含有尿嘧啶的发夹探针(UHP)及嵌入AP位点的双标记荧光探针(AFP)杂交制备出复合探针I和复合探针II。目标物UDG与复合探针I特异性结合,产生AP位点,随后通过核酸内切酶IV进行切割,并通过phi29 DNA聚合酶对不匹配的3’端进行重塑,从而产生启动初级RCA的可用引物-CT复合物。复合探针II可与初级RCA产物杂交,使AP位点嵌入到双链结构中。在Endo IV和phi29DNA聚合酶的作用下,AFP作为复合探针II的预引物转化为成熟引物,启动多级RCA反应。并且,大量的AFP被裂解,释放出很强的荧光信号。该传感器的检测限与方案一相比,提高至4.7×10~(-5) U mL~(-1)。因此,该策略可为临床诊断和基础生物医学研究中痕量分析物的检测提供技术支持。第三,基于目标物介导的引物重塑RCA激活多位点CHA策略并同时形成Y型DNA探针(Y-DNTs),构建了一种无标记荧光生物传感器,用于OTA的超灵敏检测。适配体结构切换可以通过简单的设计来实现,即环状模板、OTA适配体(S1)及RCA的预引物S2结合形成复合探针I。因此,OTA与适配体特异性结合,启动phi29 DNA聚合酶催化的引物重塑过程,该过程具有高效性、高选择性。RCA产物作为CHA的启动单元,可与大量巧妙设计的复合探针II结合成双链,实现并发的双重扩增反应。通过CHA过程可生成Y-DNTs,使两个分裂的G-四联体片段足够靠近,形成完整的G-四联体结构,并作为信号传导单元增强NMM的荧光信号输出。该方法检测限可达0.2×10~(-3) ng mL~(-1),检测范围包括4个数量级。该传感器能够准确灵敏地检测OTA,并能对实际样品进行分析。
【图文】：

码、调控和表达中发挥着多种重要作用。因此，核酸常要标志物。核酸除了具有生物学功能外，，还可作为离子的高亲和力识别分子[40-42]。核酸也可以与有机或无机材[43, 44]。DNA 扩增技术依据反应条件可以分为非等温扩扩增技术（如滚环扩增技术、催化发夹自组装反应等）术反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是最早应用的是当今实用的扩增技术，可用于目的核酸的扩增和痕量多个领域广泛应用，但其技术常需要热循环设备作为支CR 技术在资源有限的环境中和在即时检测中的应用[46]

交的短 DNA 链（引物链），这一过程被称为滚环扩增技术[49, 50]。如图 1的 RCA 过程中，DNA 聚合酶会进行基于环状模板的滚动实现数百次至大。因此，RCA 产物是与环状 DNA 模板互补并带有重复序列的非常子（长度大约是数百个纳米至微米）[51]。在此之后，RCA 作为一种新技术引起了广泛关注，并被认为是诊断基因组学和蛋白质组学中用于超蛋白质的重要技术手段[52-54]。特别是，基于挂锁探针的 RCA 技术已广析[55, 56]。该方法利用线性挂锁探针，两端通过与目标 DNA（或 RNA杂交并置。挂锁探针的两端由 DNA 连接酶链接，所得到的 DNA 环在合适（如 phi29 DNA 聚合酶等）和脱氧核苷三磷酸（dNTPs）的作用下可进CA 产物与荧光基团标记的互补 DNA 探针杂交，可通过共聚焦显微镜A 过程可以通过分子信标、荧光探针或荧光染料实现实时监控。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP212.3

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本文编号：2687051