糖传感界面构建及致病菌—甘露糖相互作用研究

发布时间：2020-06-07 20:13

【摘要】：致病菌与糖相互作用的研究可以为致病菌的分离、富集、检测、鉴别、生物膜抑制及抗生素替代药物的筛选提供新的解决方案。然而,快速、灵敏、可靠的研究方法与技术缺乏是制约其发展的重要原因。生物传感器以其独特的优势在致病菌与糖相互作用的研究中展现出良好的发展前景。本论文针对目前致病菌与糖相互作用研究需要依赖大型仪器、需要荧光标记等问题,提出利用快速、灵敏、无需标记且易于集成化和微型化的电化学阻抗生物传感器来研究致病菌与糖的相互作用,结合等温吸附模型建立定量计算致病菌与糖结合亲和力的方法。针对体外致病菌与糖结合亲和力弱和选择性差等难题,构建糖纳米传感界面和仿生拟糖蛋白界面,并结合电化学阻抗谱(EIS)和表面增强拉曼光谱(SERS)双检测模式构建可以同时获取多种有效信息的糖生物传感器,利用其研究致病菌与糖的相互作用和鉴别表达1型菌毛的不同致病菌。基于致病菌与糖的相互作用,通过糖生物传感器、糖基化磁性微球与微流控芯片的结合,为快速、有效评价糖类抗粘附试剂的效能和沙门氏菌的定量检测提供新方法。主要研究内容和结论如下:(1)构建Man/MUA-MH/Au传感界面,开展致病菌与甘露糖相互作用研究。利用自组装法和共价键固定的方法构建具有生物活性且稳定性良好的Man/MUA-MH/Au生物传感界面。通过阻抗检测和Randless等效电路模型解析,获得致病菌在甘露糖传感界面上对应的电子转移阻抗(R_(et))数据,根据弗鲁姆基等温线(Frumkin isotherm)模型,计算得出细菌与甘露糖的结合亲和力,以此建立基于阻抗检测的致病菌-糖相互作用研究的新方法。利用该方法研究了Salmonella typhimurium ATCC14028和Escherichia coli JM109与该传感界面上甘露糖的相互作用。结果显示,两种致病菌与传感界面上甘露糖的亲和力分别为K_(ADS(S.T.))=2.16×10~6(CFU/mL)~(-1)和K_(ADS(JM109))=5.84×10~3(CFU/mL)~(-1),表明该传感界面对S.typhimurium ATCC14028具有较强的选择性吸附能力,对于表达1型菌毛的E.coli JM109也具有一定的吸附能力。该方法为细菌/细胞与界面上生物分子的相互作用的定量研究提供了简单、快速、可靠的新途径。(2)构建Man/MUA-MH/Au NPs纳米传感界面,开展致病菌与糖相互作用的双模式检测研究。采用恒电位沉积法在干净的金电极表面制备金纳米粒子Au NPs,通过化学自组装法在其表面修饰得到Man/MUA-MH/Au NPs@Au纳米传感界面。采用EIS方法考察该界面与S.typhimurium ATCC14028、E.coli JM109、E.coli DH5α、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa五种致病菌的相互作用。结果显示,Man/MUA-MH/AuNPs糖界面能选择性识别表达1型菌毛(含FimH粘附素)的S.typhimurium ATCC14028和E.coli JM109,结合亲和力分别为6.859×10~(23) M~(-1)和2.054×10~(17) M~(-1),而不识别其它细菌。进一步利用纳米传感界面上纳米金的SERS效应,原位测试获得界面捕获的致病菌的SERS图谱,利用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)实现S.typhimurium ATCC14028和E.coli JM109的有效鉴别。该方法解决了目前糖生物传感器不能区别能与同一糖选择性识别的不同细菌的难题。(3)基于纳米拟糖蛋白传感界面的构建,研制集成阻抗传感细菌芯片,开展抗细菌粘附试剂效能测试研究。S.typhimurium和表达1型菌毛的E.coli与宿主细胞表面上糖蛋白而不是游离的糖选择性识别。所以,提出在纳米尺度上构建拟糖蛋白界面Man-BSA以更好的模拟细胞表面聚糖的呈现和排布方式,促进多效价相互作用的发生。设计并制备集成进样区、混合区、缓冲区、检测区和出样区的微流控芯片,在检测区集成具有新结构的微电极,通过恒电位沉积法在微电极表面制备了Au NPs,在Au NPs表面通过化学自组装法构建了纳米甘露糖-牛血清蛋白拟糖蛋白界面Man-BSA@Au NPs。利用EIS测定不同细菌对该界面的相互作用特性参数,考察、分析并评价该拟糖蛋白界面对S.typhimurium的选择性识别效能。结果表明,Man-BSA@Au NPs对S.typhimurium具有明显的选择性和高的结合亲和力,而D-Man、Me-Man、Phenyl-Man、Mannatide四种甘露糖苷类试剂均可抑制S.typhimurium粘附效果,抗粘附性能依次为Phenyl-ManMannatideMe-ManD-Man,与文献中传统方法测试结果一致,说明在微流控芯片的特定功能区构建仿生界面可实现糖类化合物抗粘附效果的有效测评。本研究为致病菌抗粘附药物的效能评价提供了简单、经济、快速的方法和技术途径。(4)基于甘露糖选择性识别沙门氏菌和大肠杆菌的特性,开展该类致病菌检测的新方法研究。研究基于Man/MUA-MH/Au、Man/MUA-MH/Au NPs和Man-BSA@Au NPs三种甘露糖传感界面的电化学阻抗生物传感器对S.typhimurium的检测性能。检测限分别为50 CFU/mL、10 CFU/mL、5 CFU/mL。其中基于Man-BSA@Au NPs传感界面和微流控芯片相结合的检测方法展现出优异的性能,除了获得较低的检测限外,只需要30 min即可完成检测。建立糖基化磁性微球分选-DEP分离富集-EIS原位检测的微流控芯片沙门氏菌检测新方法,设计并制备含有进样区、“Tesla”结构混合区、检测区和出样区的玻璃-PDMS复合式微流控芯片。实验通过含有氨基的甘露糖苷与含有羧基的四氧化三铁磁性微球反应,制备甘露糖苷修饰的磁性微球(phenyl-Man@Fe_3O_4),平均粒径为200 nm。在芯片的“Tesla”结构混合区,细菌合成样本与糖基化磁性微球充分混合,在含有阵列微电极的检测区通过介电电泳力(DEP)将糖基化磁性微球标记的沙门氏菌富集在叉指电极之间,再利用EIS原位检测细菌的含量。结果显示,阻抗变化值?Z与细菌浓度[C]在100~5×10~4CFU/mL的范围内呈现良好的线性关系,检测限为100 CFU/mL。该检测限较文献报道的DEP-EIS细菌检测方法降低了1个数量级,证明了糖基化磁性微球同时具有EIS检测信号放大的功能。所建立的方法将检测时间缩短在1 h内,在致病菌的快速检测和感染性疾病的快速诊断中具有较大的潜在应用价值。
【图文】：

示意图,致病菌,粘附,原理

1 绪论介导的致病菌粘附简介是生物体进行新陈代谢所需能量的主要来源，同时，它还调节，具有重要的生物学功能[1]。糖的生物学功能主要是通过与蛋白来实现的。可选择性识别糖的蛋白质主要包括单克隆抗体、酶集素[2]。其中，糖-凝集素选择性识别相关的生理学及病理学过感染、细胞信号传导、细胞凋亡、受精、癌症转移以及免疫调节是致病菌感染人畜的先决条件，它受到多种理化因素和生物因附素和受体共同作用的结果，具有宿主选择性、组织选择性和作为毒力因子之一的菌毛，一般会参与致病菌对宿主细胞的选择主要途径是多个菌毛凝集素与宿主细胞表面多个聚糖发生选择性）。

示意图,生物膜,纳米粒子,原理

造成了巨大的经济损失[56, 57]。最近研究表明，糖纳米粒子可以通过抑制细菌粘附来扰乱生物膜的形成（图1.4）。Barras 等[58]和 Khanal 等[59]分别合成了 Man 修饰的金刚石纳米粒子 ND-Man和 ND-Man3，，利用吸光度法测试其对 E. coli 在 96 孔板聚氯乙烯（PVC）表面上培养 24 h 后生物膜形成状况的影响。结果表明，当 ND-Man 的浓度为 80 μmol/L，ND-Man3的浓度为 21 μmol/L 时，可以显著抑制 E. coil 生物膜的形成。这可能是由于糖纳米粒子阻止了菌毛 FimH 粘附蛋白对 PVC 的粘附。当细菌先在 96 孔板上培养 24 h，等生物膜形成之后，再加入该糖纳米粒子，则不能再影响细菌生物膜的状态。图 1.4 糖纳米粒子抑制细菌生物膜原理示意图Fig. 1.4 Schematic representation of ND-mannose ability to inhibit of biofilm formationP. aeruginosa 生物膜的形成与其表面的凝聚素 LecA 和 LecB 相关。Johansson等[60]筛选出了两种针对 LecB 的岩藻糖多肽树枝状大分子 FD2(C-Fuc-LysProLeu)4(LysPheLysIle)2LysHisIleNH2和 PA8 (OFuc -LysAlaAsp)4(LysSerGlyAla)2LysHisIleNH2，其中 FD2 可以有效的抑制 P. aeruginosa 生物膜的形成（IC50=10μmol/L）及有效驱散已经形成的生物膜。这说明 LecB 的多效价糖类抑制剂可以作为抑制和驱散生物膜的有效试剂。Reymond 课题组制备了多种半乳糖苷修饰的多肽树枝状大分子，通过抑制 LecA 来抑制或驱散 P. aeruginosa 生物膜[61-63]
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O641.3;TP212.3

【参考文献】