金纳米棒、聚合物点传感器的构建及其在酶活性检测中的应用

发布时间：2020-06-22 20:29

【摘要】：生物传感器是一种以生物活性单元为敏感元件,结合化学、物理转换元件,对各种生物、化学物质具有高度选择性的分析系统。与传统复杂费时的检测方法相比,生物传感器具有成本低、选择性好、灵敏度高以及快速、微型化等优点,被广泛用于环境监测、食品安全、疾病诊断等领域。纳米技术的兴起为生物传感领域的发展提供了新的动能,由于纳米材料具有优良的光学、电学、磁学等性能,能够增加传感器的灵敏度,降低检出限,在生物传感中应用广泛。鉴于此,本论文以金纳米棒(AuNRs)和聚合物点(PDs)为基础,分别构建了不同的生物传感器,用于四种酶活性的检测以及相应酶抑制剂的筛选。具体工作如下:1.在第二章中,基于I_2对AuNRs的刻蚀成功构建了一种用于α-葡萄糖苷酶活性检测的超灵敏比色检测传感器。在该方法中,利用2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)作为酶底物,水解产生抗坏血酸,将KIO_3还原成I_2,使AuNRs发生刻蚀。AuNRs形貌的改变导致其纵向等离子共振吸收(LSPR)峰蓝移,同时AuNRs溶液由蓝色变成红色,从而实现了α-葡萄糖苷酶活性的可视化检测。实验结果显示,α-葡萄糖苷酶浓度在2.5 U/L到45 U/L范围内,AuNRs的纵向等离子共振吸收峰的偏移值与酶浓度之间呈现良好的线性关系,并且达到了目前为止最低的α-葡萄糖苷酶检出限0.5 U/L(S/N=3)。这种方法具有成本低、操作简便、灵敏度高、选择性高等特点,并且成功地应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。2.在第三章中,利用温和的条件合成了一种稳定性好、生物毒性低、量子产率高达53.6%的PDs。其形貌、成分、光学性质通过透射电子显微镜、傅里叶红外光谱仪、紫外-可见吸收光谱仪、荧光光谱仪、X射线光电子能谱仪、X射线衍射仪进行表征。同时,利用制备的PDs构建了一种用于碱性磷酸酶(ALP)活性检测的荧光传感器。对硝基苯磷酸二钠(PNPP)作为ALP的水解底物,被ALP水解产生对硝基苯酚(PNP),PNP的紫外-可见吸收与PDs的荧光激发光谱重叠,从而发生内滤效应导致PDs的荧光猝灭或减弱,通过荧光强度的变化实现对ALP活性的检测。传感系统对ALP的检出限为0.01 U/L(S/N=3),线性范围为0.01 U/L到20 U/L。同时,利用该传感系统进行了人血清中ALP活性的测定以及ALP抑制剂的筛选,并取得了满意的结果。3.在第四章中,构建了一种基于PDs通过荧光内滤效应(IFE)进行α-L-岩藻糖苷酶(AFu)活性检测的生物传感器。该传感器的检测机制是利用4-硝基苯基-α-L-岩藻吡喃糖苷(PNPF)在AFu催化水解后的产物对硝基苯酚(PNP)与PDs之间的内滤效应,导致PDs的荧光猝灭或减弱,通过荧光强度的变化实现对AFu活性的检测。传感系统在酶浓度0.01 U/L-0.9 U/L范围内均表现出良好的线性关系,且取得了目前最低的AFu检出限0.001 U/L(S/N=3),该检测方法成功应用于人血清中AFu活性的测定。此外,还成功合成了一种新的化合物(AA-2βFuc),通过PDs传感器检测发现,AA-2βFuc对AFu表现出一定的抑制作用。4.在第五章中,构建了一种高灵敏度、高选择性的基于PDs的荧光传感器,以对苯二胺(PPD)作为底物,用于辣根过氧化物酶(HRP)活性和葡萄糖含量的检测。HRP/H_2O_2催化系统将PPD催化氧化生成褐色的产物PPDox,PPDox在510 nm处的紫外-可见吸收峰与PDs的荧光激发和发射光谱发生了重叠,由于产生荧光内滤效应导致荧光信号减弱,通过荧光强度的变化实现对HRP活性的检测。同时,在葡萄糖氧化酶(Gox)催化葡萄糖转化生成H_2O_2的基础上,该传感系统还进一步实现了葡萄糖含量的检测。该传感系统灵敏度高,对HRP活性的检出限为0.001 ng/mL,对葡萄糖的检出限为0.1μmol/L。此外,将该传感方法进一步拓展到基于HRP的荧光酶联免疫分析,用于Cry1Ab/Ac蛋白测定和水稻叶样本的分析,并取到了满意的结果。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP212;O657.3;TB383.1
【图文】：

原理图,生物传感器,原理图

结合化学、物理转换元件，对目标分析物具有高度选择性的检测器（图1-1）(Gerard et al 2002, 马莉萍 2009)。生物传感器具有针对性强、速度快、操作简单等特点，只需少量样品即可进行检测(Gerard et al 2002)，已经被广泛应用于农业生产、食品安全、环境检测和医学研究等领域(Turner 2013, Zhu et al 2014)。回顾过去数十年生物传感器的发展，纳米材料的使用显著提高了生物传感器的检测灵敏度和选择性，许多研究已经证明了纳米材料在生物传感应用方面的适用性(Holzinger et al2014, Kumar et al 2015)。金纳米棒（Gold Nanorods，AuNRs）和聚合物点（Polymer Dots，PDs）是近些年发展起来的两种新型纳米材料，AuNRs 作为一种各向异性纳米材料，以其独特的光学和光热性能而被广泛应用(Hwang and Tao 2010, Wang et al 2016, Haine andNiidome 2017)。PDs 是一种新兴纳米荧光材料

示意图,晶种法,种子,溶液

et al 2001b)。该方法是在柠檬酸盐作为保护剂下，利用硼氢化钠酸还原得到金种子溶液。然后将金种子溶液加入到生长溶液中，、硝酸银、抗坏血酸、CTAB 组成。其中，抗坏血酸的弱还原性 Au+，Ag+可以促进 AuNRs 的生成。通过改变加入金种子溶液的比在 1-10 之间的 AuNRs。随后，2004 年，El-Sayed 研究组在此进，采用 CTAB 保护的单晶种子代替柠檬酸盐的晶种子，大大提和收率（超过 95 %）(Nikoobakht and El-Sayed 2003)。该方法是利溶液将氯金酸还原得到金种子溶液，然后利用抗坏血酸将 CTA成 Au+。将金种子溶液加入生长液后，通过加入不同量的 A径比（1.5-4.5 之间）。2005 年，Wu 等人在 Murphy 研究组的基础中加入硝酸，合成了长径比达 21-23 的 AuNRs，其长度可达 40 et al 2005)。

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