生物源纳米硒对肝癌HepG2细胞抑制活性研究及其在传感器中的应用

发布时间：2020-08-27 12:50

【摘要】：硒是生物必需的微量元素,对生物有机体的健康起到了非常重要的作用。纳米硒(selenium nanoparticles,SeNPs)是一种红色的单质硒,相对于其它形式的硒而言,因其优越的生物学活性和较低的毒性成为研究者研究的热点。目前,关于纳米硒的研究主要集中在化学合成的纳米硒,而生物合成的纳米硒的研究还较少。本学位论文利用实验室保藏的一株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)N菌株还原亚硒酸盐获得高纯度的生物源纳米硒(biogenic SeNPs,bioSeNPs)。首先,对bioSeNPs的生物吸收利用率以及在体外诱导人肝癌HepG2细胞产生凋亡及其机制进行了研究;其次,在构建了裸鼠HepG2细胞移植瘤模型的基础上,研究了bioSeNPs在裸鼠体内抑制HepG2细胞移植瘤的生长及其机制。另外,利用bioSeNPs修饰玻碳电极(GCE),构建了bioSeNPs/GCE非酶传感器并对过氧化氢(H_2O_2)进行了定量分析。研究结果主要表现在以下五个方面:1.R.palustris N菌株能够将亚硒酸钠还原为红色bioSeNPs。在温度为30℃、光照厌氧、培养基初始pH为7.0和接种量15%的条件下,R.palustris N菌株对浓度为1.0 mmol·L~(-1)的亚硒酸钠的去除率达到99.9%以上,最大耐受亚硒酸钠浓度大于8.0 mmol·L~(-1)。2.BioSeNPs在体外细胞水平上,表现出与亚硒酸钠相似的提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力的能力;在小鼠体内,bioSeNPs在硒的蓄积和提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力上,同样被证实具有与亚硒酸钠相似的活性。3.BioSeNPs对人肝癌HepG2细胞具有显著的生长抑制作用。利用R.palustris N菌株还原亚硒酸钠获得高纯度的bioSeNPs,粒径在91.28-531.2 nm,平均为165.9 nm。BioSeNPs对人肝癌HepG2细胞具有显著的生长抑制作用且具有浓度效应关系。经BioSeNPs处理的人肝癌HepG2细胞发生皱缩,表面微绒毛消失,细胞内出现大量空泡,细胞膜向内包裹细胞内容物并形成凋亡小体;流式细胞术分析显示,细胞凋亡率随bioSeNPs浓度的增加而逐渐上升,并呈现一定的浓度效应关系;细胞凋亡的发生依赖caspase级联反应的活化,推测死亡受体通路和线粒体通路均发挥了作用。4.BioSeNPs对裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤的生长具有较强的抑制作用。抑制率高达51.72%。但是,BioSeNPs对裸鼠没有显著的毒副作用,推测bioSeNPs的抑瘤机制与其细胞毒性无关,而提高机体抗氧化水平可能在这其中发挥了一定作用。5.利用R.palustris获得的高纯度bioSeNPs成功构建了一种非酶传感器。结果表明,实验构建的非酶传感器在H_2O_2的定量分析上表现出灵敏度高且工艺简单等特点,检出限达到33.3μmol·L~(-1),线性范围在0.1-5.0 mmol·L~(-1)。综上所述,本学位论文首次利用R.palustris获得了高纯度的bioSeNPs,证实bioSeNPs具有较高的生物吸收利用性,且可以通过诱导HepG2细胞产生凋亡而抑制其生长;同时,bioSeNPs表现出对H_2O_2具有良好的催化性能。研究结果将为bioSeNPs用于开发新型抗肝癌药物以及在化学非酶传感器上的应用奠定了科学依据和应用基础。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TP212;R735.7
【图文】：

学位论文,整体构思,实验设计,主要内容

本学位论文的研究思路和主要内容Fig.1.1Experimentaldesignandmaincontentsofthisdissertation

亚硒酸钠,沼泽红假单胞菌,菌体

如图 2.1 可知，R. palustris N 菌株能够在亚硒酸钠培养基中生长，并且在培养 72 h 后达到对数生长期。N 菌株在不同亚硒酸钠浓度（0-8.0 mmol·L-1）下的生长动力学显示，随着亚硒酸钠浓度的增加 N 菌株可达到的最大菌体细胞数量（图 2.1A）和蛋白质含量（图 2.1B）都显著降低（P < 0.05）。菌体细胞数量与菌体蛋白质含量的变化趋势基本一致。随着亚硒酸钠浓度的增加，N 菌株的生长受到越来越严重的抑制。在发酵 120 h 后，与亚硒酸钠浓度为 0 mmol·L-1相比，当亚硒酸钠浓度为 1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、4.0 mmol·L-1和 8.0 mmol·L-1时，N 菌株生长受到的抑制率分别为 7.3％、24.5％、62.1％和 81.7％。为了进一步评估 N 菌株对亚硒酸钠的抗性，以菌体细胞对数生长期的平均生长速率（k）与亚硒酸钠培养基中亚硒酸钠浓度（c）进行非线性拟合（如图 2.2），亚硒酸钠浓度对菌体细胞平均生长速率影响的回归方程为：k =0.127exp（-0.29c），R2=0.978。根据回归方程计算亚硒酸钠对平均生长速率抑制 50% 时的浓度，即 EC50为 2.4mmol·L-1。

亚硒酸钠,沼泽红假单胞菌,菌体,生长速率

图 2.2 亚硒酸钠对沼泽红假单胞菌菌体细胞平均生长速率的影响Fig. 2.2 Influence of selenite on average growth rate of R. palustri单胞菌对亚硒酸钠的还原动力学研究3 所示，随着 R. palustris N 菌株菌体的生长亚硒酸钠浓·L-1亚硒酸钠的条件下，当菌体生物量处于对数增长期时速的增加，在 196 h 基本降解完成（图 2.3A）。随着亚硒株对亚硒酸钠的还原能力明显出现下降趋势（图 2.3B）。2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1时，216 h 后菌体的亚硒酸钠还0％、31.7％和 2.4％。

【参考文献】