毕赤酵母丙二酰辅酶A生物传感器构建及代谢动态控制应用
发布时间：2020-12-09 22:07
代谢工程改造已成为提高微生物天然生产及异源合成各种高附加值产物产量与得率的常用技术手段。传统代谢工程技术多采用静态控制策略,主要为合成途径限速酶的过表达、竞争途径的敲除/低、ATP供应的优化控制、氧化还原反应的平衡及前体代谢的调控等,以此重新分配稳态通路的通量。但是,这种工程菌株往往不能对基因表达进行动态响应及调控,适应环境变化的鲁棒性低。动态控制策略可以使细胞持续感应培养体系的环境变化,重新平衡核心代谢途径的通量,调控生理状态及代谢特征。因此,动态控制可以更好地平衡菌株生长、代谢与目标产物合成,减少有毒中间体的积累,而且异源途径酶表达的动态控制可以有效地降低外源多酶共表达的代谢压力。近年来,启动子文库的高通量筛选及合成生物学技术的快速发展,为动态控制策略的实现提供了重要支持,但目前有关动态控制策略的报道多集中于原核细胞,酵母及高等真核细胞的工作则很少,这主要与真核细胞复杂的转录调控机制有关。丙二酰辅酶A（Mal-CoA）是聚酮、黄酮、脂肪酸等活性分子生物合成的重要前体,也是参与细胞生理反应的关键代谢分子。通常情况下,细胞内Mal-CoA浓度很低,提取定量后进行代谢调控存在诸多困难,在...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１酵母Ａｃｃｌ保守功能域??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｄｏｍａｉｎ?ｏｆ?Ａｃｃｌ?ｉｎ?ｙｅａｓｔ．??１．２．３丙二酰辅酶Ａ衍生化合物??
高附加值Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生??化合物，更是引起了研宄人员的广泛兴趣。Ｍａｒｘ等ｆ３５］报道了通过用强组成型启动子Ｐｍｐ??取代天然启动子在酵母中异源高效合成核黄素的途径。使用具有三个启动子表达的??途径基因的工程化酵母，用于生产生物柴油，也取得了进展％。本实验室高丽梅硕士??（６－ＭＳＡ）［３７］、刘一奇博士（洛伐他汀和莫纳可林乃网、薛莖硕士（梧霉素）岡、孔垂杏硕??士（土曲霉酸）等，己成功实现各类聚酮化合物在毕赤酵母中的异源合成。??各类Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生化合物在细胞内的合成途径如图１．２所示。整个代谢途径的限速??步骤在于Ｍａｌ－ＣｏＡ。由于Ｍａｌ－ＣｏＡ与细胞生长以及磷脂和脂肪酸的合成直接相关，细??胞内浓度受到严格调节，维持在非常低的水平，难以定量调控，可用性被限制，影响了??一系列下游化合物的合成。随着在生物合成级联反应中引入新基因，对细菌进行工程改??造，在细胞生长所需的Ｍａｌ－ＣｏＡ和产物合成之间实现新陈代谢的平衡，是至关重要的。??细胞内Ｍａｌ－ＣｏＡ的有效利用，仍然是生产聚酮化合物和黄酮等的最大障碍之一。对不??同碳源而言，葡萄糖廉价且安全，但对于Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生物合成而言，葡萄糖在细胞内??代谢为Ｍａｌ－ＣｏＡ代谢步骤多，分支繁杂。乙醇作为碳源，在细胞内经过乙醇－乙醛－乙酸??－乙酰辅酶Ａ四个步骤，即可生成Ｍａｌ－ＣｏＡｌ３８】。因此，乙醇作为一种碳源用于Ｍａｌ－ＣｏＡ??的合成，是很有潜力的。本课题所用毕赤酵母为非葡萄糖效应酵母，具有高效的乙醇同??化能力，可有效促进Ｍａｌ－ＣｏＡ的合成［３８］。??Ｇｌｕｃｏｓｅ??Ｐｙｒｕｖａｔｅ?????｜Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ?｜．?Ｂｊ０．ｐ０｜ｙ
ｔｏｒ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ??Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ａｃｔｉｎｇ?ｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｉｎ??ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??＿?ＮＵＣ［ｔ＾〇ｍｅ?化??ｄ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｅｓｃａｐｅ?ｃ?ＰＩＣ?ｆｏｒｍａｔｉｏｎ??ｉ＞?Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?Ｐｏｌ?ＩＩ?＼?ＴＦｌ＾ｔ＾ＴＦＩＩＨ?Ｍｅｄｉａｔｏｒ??ｙ?＾ＪｃＶ?ＣＴＤ?ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ?Ｍ?＾?＿??ｐｌｃ??图１．５?ＲＮＡ聚合酶ＩＩ介导的基因转录过程??Ｆｉｇ．?１．５?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｂｙ?ＲＮＡ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＩＩ［１２０ｌ??１．６本课题设计背景及原理??Ｍａｌ－ＣｏＡ是所有活细胞脂肪酸合成的重要中间体，也是革兰氏阳性菌脂质平衡调节??过程中的全局调控因子。体外转录和结合研宄表明，Ｍａｌ－ＣｏＡ是枯草芽孢杆菌ＦａｐＲ的??直接特异性诱导剂。ＦａｐＲ是一种保守的转录抑制因子，调控参与细菌脂肪酸和磷脂合??成的多个基因的表达。序列分析表明，ＦａｐＲ像许多细菌抑制因子一样，具有Ｎ端ＤＮＡ??结合域（ＤＢＤ），可与一段３４?ｂｐ的ＤＮＡ序列／印（９结合（Ａ?＝?０．１２?ｐｍｏｌ／Ｌ）；同时Ｃ端??的晶体结构揭示了?ＦａｐＲ是一种具有硫酯酶样“热狗”折叠的同源二聚体蛋白，其类似??于几种己知的结合酰基辅酶Ａ底物的硫酯酶，可特异性结合Ｍａｌ－ＣｏＡ?（ＡＴｄ?＝?２．４?ｐｍｏｌ／Ｌ）。??Ｎ端和Ｃ端结构域通过一个ａ螺旋连接（图１．６）。??ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ??ｄｏｍａｉｎ?Ｍａｌ－ＣｏＡ?ｂｉｎｄ
【参考文献】：
博士论文
[1]基于甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫纳可林J异源生物合成[D]. 刘一奇.华东理工大学 2018
本文编号：2907555
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１酵母Ａｃｃｌ保守功能域??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｄｏｍａｉｎ?ｏｆ?Ａｃｃｌ?ｉｎ?ｙｅａｓｔ．??１．２．３丙二酰辅酶Ａ衍生化合物??
高附加值Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生??化合物，更是引起了研宄人员的广泛兴趣。Ｍａｒｘ等ｆ３５］报道了通过用强组成型启动子Ｐｍｐ??取代天然启动子在酵母中异源高效合成核黄素的途径。使用具有三个启动子表达的??途径基因的工程化酵母，用于生产生物柴油，也取得了进展％。本实验室高丽梅硕士??（６－ＭＳＡ）［３７］、刘一奇博士（洛伐他汀和莫纳可林乃网、薛莖硕士（梧霉素）岡、孔垂杏硕??士（土曲霉酸）等，己成功实现各类聚酮化合物在毕赤酵母中的异源合成。??各类Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生化合物在细胞内的合成途径如图１．２所示。整个代谢途径的限速??步骤在于Ｍａｌ－ＣｏＡ。由于Ｍａｌ－ＣｏＡ与细胞生长以及磷脂和脂肪酸的合成直接相关，细??胞内浓度受到严格调节，维持在非常低的水平，难以定量调控，可用性被限制，影响了??一系列下游化合物的合成。随着在生物合成级联反应中引入新基因，对细菌进行工程改??造，在细胞生长所需的Ｍａｌ－ＣｏＡ和产物合成之间实现新陈代谢的平衡，是至关重要的。??细胞内Ｍａｌ－ＣｏＡ的有效利用，仍然是生产聚酮化合物和黄酮等的最大障碍之一。对不??同碳源而言，葡萄糖廉价且安全，但对于Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生物合成而言，葡萄糖在细胞内??代谢为Ｍａｌ－ＣｏＡ代谢步骤多，分支繁杂。乙醇作为碳源，在细胞内经过乙醇－乙醛－乙酸??－乙酰辅酶Ａ四个步骤，即可生成Ｍａｌ－ＣｏＡｌ３８】。因此，乙醇作为一种碳源用于Ｍａｌ－ＣｏＡ??的合成，是很有潜力的。本课题所用毕赤酵母为非葡萄糖效应酵母，具有高效的乙醇同??化能力，可有效促进Ｍａｌ－ＣｏＡ的合成［３８］。??Ｇｌｕｃｏｓｅ??Ｐｙｒｕｖａｔｅ?????｜Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ?｜．?Ｂｊ０．ｐ０｜ｙ
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【参考文献】：
博士论文
[1]基于甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫纳可林J异源生物合成[D]. 刘一奇.华东理工大学 2018
本文编号：2907555
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