基于抗生素亲合作用的化学发光分析法检测致病菌

发布时间：2017-10-13 02:36

  本文关键词：基于抗生素亲合作用的化学发光分析法检测致病菌

  更多相关文章： 化学发光 万古霉素 功能化磁珠 致病菌 免疫球蛋白G

【摘要】：致病菌是一种可通过空气,食物,水和生物接触等各种途径入侵宿主并引起感染的微生物。其中,金黄色葡萄球菌是一种很常见的致病菌,能够引起诸如肠炎,败血症,脓毒症等严重感染,也是引起群体性食物中毒的第二大因素。变异链球菌是一种生长于口腔的致病菌,具有分泌酸性物质腐蚀牙釉质的特点,为人类主要致龋齿菌之一,在口腔医学领域被广泛研究。因此,建立对这两种致病菌快速,简单,灵敏检测的新方法对于疾病诊断具有重要的意义。化学发光(Chemiluminescence,简称为CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类,它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与化学发光强度在一定范围内呈线性定量关系的原理,利用仪器对反应体系化学发光强度的检测,来确定待测物含量的一种痕量分析方法。本文基于化学发光分析法,结合抗生素亲合作用和双位点分子识别模式构建了检测致病菌的新方法。1)基于抗生素功能化磁珠的化学发光分析法检测金黄色葡萄球菌本文基于抗生素功能化的磁珠构建了化学发光分析检测金黄色葡萄球菌的方法。本研究选用万古霉素作为其中一种分子识别试剂,偶联在羧基化磁珠上,实现对金黄色葡萄球菌的高效富集和快速分离。同时,利用金黄色葡萄球菌表面的A蛋白可以与兔免疫球蛋白G(Ig G)进行特异性结合作用的特点,同时使用碱性磷酸酶(ALP)标记的兔Ig G作为第二种分子识别试剂和信号示踪物,在离心管中进行孵育后,通过磁性分离得到夹心复合物,即可检测复合物的化学发光信号值。结果表明,金黄色葡萄球菌的浓度在12-1.2×106 CFU mL-1范围内与化学发光强度呈良好的线性关系,检测限为3.3 CFU mL-1(信噪比为3)。本方法表现出良好的特异性。将该方法应用到实际样品检测中,将湖水、牛奶、人尿液和人血液作为样品进行加标回收实验,回收率由70.0%到116.7%不等。因此该方法具有成本低廉,灵敏度高,特异性好,操作简单,反应时间快的优点,具有较好的应用前景。2)基于双位点分子识别模式的化学发光分析法检测人口腔中的变异链球菌本文基于双位点分子识别模式,构建了检测人体口腔中变异链球菌的化学发光分析新方法。与金黄色葡萄球菌表面的A蛋白不同的是,变异链球菌表面的G蛋白可以与大鼠Ig G2a进行特异性结合,而A蛋白很少结合或者不结合。利用变异链球菌的这个特性,将大鼠IgG2a与羧基化磁珠偶联得到第一分子识别试剂。同时,我们选用万古霉素作为第二分子识别试剂,并标记ALP制备高灵敏的化学发光探针,进一步提高了本方法的特异性和灵敏度。在离心管中完成结合反应后,分离出夹心复合物并进行化学发光检测。结果表明,变异链球菌在24-2.4×105 CFU mL-1范围内可与化学发光强度呈线性关系,检测限为8 CFU m L-1(信噪比为3)。将该方法应用于检测健康成年人的唾液,回收率由70.8%到108.3%不等。本方法具有快速,高灵敏,高特异的特点,在实际应用中有较大应用潜力。
【关键词】：化学发光 万古霉素 功能化磁珠 致病菌 免疫球蛋白G
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;R446.5
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 主要缩写符号对照表10-11
• 第1章 绪论11-29
• 1.1 引言11
• 1.2 化学发光反应基础理论11-13
• 1.2.1 化学发光反应原理11-12
• 1.2.2 化学发光分析法基本原理12-13
• 1.3 常用的化学发光反应体系13-17
• 1.3.1 鲁米诺化学发光体系13-14
• 1.3.2 1, 2-二氧杂环丁烷类化学发光体系14-15
• 1.3.3 过氧化草酸酯类化学发光体系15-16
• 1.3.4 吖啶酯类化学发光体系16
• 1.3.5 酸性高锰酸钾化学发光体系16-17
• 1.4 化学发光分析法的分类17-19
• 1.5 化学发光分析法致病菌检测中的应用19-24
• 参考文献24-29
• 第2章 基于抗生素功能化磁珠的化学发光分析法检测金黄色葡萄球菌29-45
• 2.1 引言29-30
• 2.2 实验部分30-33
• 2.2.1 试剂30-31
• 2.2.2 仪器31
• 2.2.3 金黄色葡萄球菌培养，处理及计数31
• 2.2.4 MBs-vanc的制备31
• 2.2.5 藻红荧光蛋白偶联万古霉素（PE-vanc）的制备31-32
• 2.2.6 表征32
• 2.2.7 金黄色葡萄球菌的检测以及标准曲线的建立32-33
• 2.3 结果与讨论33-41
• 2.3.1 PE-vanc的分离纯化33
• 2.3.2 基于功能化磁珠检测金黄色葡萄球菌的机理33-35
• 2.3.3 MBs-vanc对金黄色葡萄球菌作用分析35
• 2.3.4 条件优化35-37
• 2.3.5 特异性分析37-39
• 2.3.6 标准曲线的建立39-40
• 2.3.7 实际样品检测40-41
• 2.4 结论41-42
• 参考文献42-45
• 第3章 基于双位点识别模式的化学发光分析法检测变异链球菌45-58
• 3.1 引言45-46
• 3.2 实验部分46-48
• 3.2.1 试剂46
• 3.2.2 仪器46-47
• 3.2.3 变异链球菌培养，，处理及计数47
• 3.2.4 磁珠偶联大鼠IgG2a （MBs-大鼠IgG2a）的制备47
• 3.2.5 ALP标记万古霉素（ALP-vanc）的制备47
• 3.2.6 表征47-48
• 3.2.7 变异链球菌的检测以及标准曲线的建立48
• 3.3 结果与讨论48-54
• 3.3.1 基于功能化磁珠检测变异链球菌的机理48-49
• 3.3.2 ALP-vanc的分离纯化49
• 3.3.3 ALP-vanc对变异链球菌的作用分析49-50
• 3.3.4 扫描电镜表征50-51
• 3.3.5 条件优化51-52
• 3.3.6 特异性分析52-53
• 3.3.7 标准曲线的建立53-54
• 3.3.8 实际样品检测54
• 3.4 结论54-56
• 参考文献56-58
• 致谢58-60
• 发表论文及参加课题一览表60

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本文编号：1022378