microRNA-449b对脓毒症小鼠高迁移率族蛋白B1介导树突状细胞免疫功能障碍的影响

发布时间：2017-11-05 09:01

  本文关键词：microRNA-449b对脓毒症小鼠高迁移率族蛋白B1介导树突状细胞免疫功能障碍的影响

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【摘要】：目的:探讨miR-449b在高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)调控树突状细胞(dendritic cell,DC)免疫效应中的作用及其对脓毒症小鼠免疫功能障碍的影响。方法:1 HMGB1分别以10、100、1000 ng/ml剂量刺激正常小鼠脾脏来源的CD11c+DC,并分别于24 h、48 h及72 h检测DC表面标志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHC-II)、细胞因子分泌(IL-12、IL-10)以及DC凋亡的改变;并用QPCR检测12 h、24 h、48 h细胞内miR-449b改变。2 DC转染miR-449b模拟物(miR-449b)、抑制物(In-miR-449b)及相应对照(miR-NC、In-miR-NC)后,HMGB1(100 ng/ml)刺激48h收取细胞,检测DC表面分子、细胞因子(IL-12、IL-10)、凋亡改变以及与T细胞混合培养后T细胞增殖、分化功能的变化;进一步应用miRNA相关预测软件及结合相关文献确定miR-449b介导这一过程中的潜在靶蛋白Notch1和Sirt1,并用western blot研究miR-449b对靶蛋白的影响。3复制小鼠CLP模型,术后48h及120h分别通过尾静脉注射miR-449b antagomir及对照(8mg/kg,300ul),观测脓毒症小鼠10天生存率。此外于术后第7天通过腹腔注射LPS(10ug/只)给予二次打击,在6h后检测各组小鼠血清中IL-12及IL-10水平、脾脏中成熟DC所占比例以及脾脏DC表面分子表达、凋亡率及其对CD4+T细胞增殖分化的影响。结果:1 HMGB1刺激DC后,其表面分子及细胞因子IL-12随着时间及剂量的增加表达上调,其中以48 h、100 ng/ml组上调最为明显,而大剂量(1000 ng/ml)时及72 h组表达有所下调;随着HMGB1剂量及刺激时间的增加,DC凋亡率升高,细胞因子IL-10分泌增加(P0.05);miR-449b在12 h及24 h组表达下调,100及1000 ng/ml组在48 h表达明显上调(P0.05)。2转染miR-449b可上调其在细胞内表达,而抑制物可抑制其表达;上调miR-449b后HMGB1(100 ng/ml)刺激48 h DC表面分子CD86表达显著上调(P0.05)、凋亡增加(P0.01)、细胞因子IL-10分泌增多(P0.05),对T细胞的共刺激增殖效应减弱及混合性淋巴细胞反应中IL-4水平增多(P0.01)、IFN-γ水平下降(P0.05);miR-449b的过表达可抑制靶蛋白Notch1及Sirt1的表达。3抑制miR-449b能明显改善晚期脓毒症小鼠的病死率,进一步研究发现抑制miR-449b的表达能明显增加晚期脓毒症小鼠血清中IL-12的水平(P0.05)、树突状细胞在脾脏中的比例(P0.01)和表面分子MHC-II(P0.05)、CD80(P0.05)的表达以及减少凋亡(P0.05)和血清中IL-10的水平(P0.05),促进T细胞的增殖(P0.05)及向功能性Th1极化;miR-449b antagomir组靶蛋白Notch1及Sirt1有所上调。结论:HMGB1介导小鼠脾脏DC成熟分化过程中miR-449b起重要的负性调控作用,并明显促进HMGB1刺激诱导的DC凋亡;抑制miR-449b表达水平可有效改善脓毒症小鼠病死率及脾脏DC的免疫功能状态,可能是缓解机体免疫功能障碍的重要调控靶点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

【参考文献】

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本文编号：1143474