胡黄连苷Ⅱ对急性脓毒性肝损伤小鼠的保护及机制研究

发布时间：2018-01-03 13:13

  本文关键词：胡黄连苷Ⅱ对急性脓毒性肝损伤小鼠的保护及机制研究　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究目的脓毒症所致的多脏器功能衰竭(MOF),在危重症医学领域仍是危害人类健康的重大难题,而脓毒性肝损伤目前在临床上病死率一直居高不下。因此亟待探索其发病机制和有效的治疗药物以改善预后。胡黄连苷Ⅱ(Picroside II,Pic II)的抗炎、抗细胞凋亡等药理作用目前已得到公认,而对脓毒性肝损伤研究甚少。本课题拟通过腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖苷(LPS/D-GalN)构建经典的急性肝损伤(ALI)动物模型,采用荧光定量PCR、流式细胞术、酶联免疫吸附实验等实验技术,观察胡黄连苷Ⅱ对急性脓毒性肝损伤的保护作用;体外实验探讨胡黄连苷Ⅱ抗细胞凋亡、焦亡的作用机制。研究方法1.胡黄连苷Ⅱ对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性脓毒性肝损伤的影响(1)C57BL/6雄性小鼠40只,随机分为生理盐水(NS)组,ALI组、ALI+PicⅡ组、PicⅡ组,每组10只。ALI+PicⅡ组及PicⅡ组分别于LPS/D-GalN注射前24h,12h,6h,1h四个时间点腹腔注射20mg/kg胡黄连苷Ⅱ,NS组和ALI组同时间同剂量腹腔注射NS;接下来ALI+PicⅡ组与ALI组腹腔注射LPS10μg/只和D-GalN 800mg/kg,NS组和Pic II组腹腔注射等剂量的NS,观察造模后16h内小鼠生存率。(2)C57BL/6雄性小鼠12只,分为上述4组,每组3只。处理同上,于造模后5h眼球静脉采血,颈脱臼处死小鼠。分别检测血清炎症因子TNF-α、IL-6,ALT、AST水平;观察各组小鼠肝组织大体形态,肝HE染色,检测肝组织TNF-α、IL-6mRNA表达水平,综合评价各组肝功能状态。提取各组剩余肝组织的肝细胞,流式细胞术(FCM)检测Annexin V-PE,caspase-1-FITC,7AAD的荧光强度变化;罗丹明123检测线粒体膜电位变化;Western Blot检测caspase-3活化水平,pro-caspase-1,caspase-1(p20)蛋白的表达。2.胡黄连苷Ⅱ抗凋亡、焦亡的作用机制(1)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬细胞,分为对照组(A组),胡黄连苷Ⅱ组(B组),LPS组(C组),LPS+胡黄连苷Ⅱ组(D组)。Western Blot检测pJNK、Bcl-2/Bax表达,探索Pic II抗细胞凋亡的分子机制。(2)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬细胞,分为对照组(E组),胡黄连苷Ⅱ组(F组),LPS+ATP组(G组),LPS+ATP+胡黄连苷Ⅱ组(H组)。ELISA检测上清IL-1β、IL-18水平;Western Blot检测pro-caspase-1,caspase-1(p20),NLRP3、ASC变化,探索Pic II抗细胞焦亡的分子机制。研究结果1.与NS组相比,ALI组小鼠16h生存率明显下降,ALI+PicⅡ组较ALI组升高。血清TNF-α、IL-6,ALT、AST含量,肝组织TNF-α、IL-6 mRNA在ALI组表达显著升高(P0.05);ALI+PicⅡ组上述各指标比ALI组下降(P0.05),ALI+PicⅡ组比PicⅡ组高(P0.05)。2.肝脏外观:ALI组肝脏肿大,被膜紧张,明显淤血和出血,而ALI+PicⅡ组仅为轻度淤血。肝脏病理切片经HE染色显示ALI组肝细胞坏死,大量炎症细胞浸润和充血,ALI+PicⅡ组则表现为轻度的病理改变。肝细胞经Annexin V/7AAD染色后,ALI组肝细胞凋亡率明显高于NS组(P0.05),ALI+PicⅡ组较ALI组凋亡率下降(P0.05)。罗丹明123染色显示ALI组阳性率明显高于NS组(P0.05),ALI+PicⅡ组阳性率低于PicII组(P0.05)。经caspase-1/7AAD染色结果显示:ALI组肝细胞的焦亡率明显高于NS组(P0.05),ALI+PicⅡ组较ALI组下降,但高于PicⅡ组(P0.05)。四组pro-caspase-3表达差异无统计学意义(P0.05),ALI组活化的caspase-3明显高于NS组(P0.05),ALI+PicⅡ组高于PicⅡ组(P0.05);各组pro-caspase-1表达含量无统计学意义(p0.05)。ALI组活化的caspase-1表达明显高于NS组(P0.05),ALI+PicⅡ组高于PicⅡ组(P0.05)。3.体外细胞实验:细胞凋亡模型经胡黄连苷II干预后显示:B组p-JNK明显高于A组,C组比B组下降,C组比D组表达增高(P0.05);B组Bcl-2/Bax明显低于A组,C组比B组升高,C组比D组表达增高(p0.05);细胞焦亡模型经胡黄连苷II干预后显示:F组细胞上清IL-1β、IL-18浓度明显高于E组(P0.05),G组低于F组(P0.05)。Western Blot检测NLRP3,ASC,caspase-1(p20)变化:F组明显高于E组(P0.05),G组比F组下降(P0.05),G组比H组高(P0.05)。结论1.胡黄连苷Ⅱ抑制LPS/D-GalN诱导的小鼠肝损伤的炎症反应,减轻肝细胞的凋亡和焦亡,改善脓毒症小鼠肝损伤,降低脓毒症小鼠肝损伤的死亡率。2.胡黄连苷Ⅱ抑制凋亡的机制可能是通过线粒体内源性途径抑制Bax,促进Bcl-2表达,从而抑制caspase-3活性;抑制细胞焦亡的可能机制为通过抑制NLRP3炎性小体的活化,从而抑制IL-1β和IL-18释放,保护急性脓毒性肝损伤。
[Abstract]:The effects of picroside 鈪，

本文编号：1374023