Wnt5a与Syndecan-1在小鼠脓毒症致急性肺损伤的表达研究

发布时间：2018-03-19 01:17

  本文选题：脓毒症　切入点：急性肺损伤　出处：《天津医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:脓毒症是重症监护病房的危重病,病情进展迅速,错过最佳治疗时机容易导致抗炎反应和促炎反应失控,大量炎症反应因子产生,即“炎症瀑布”,严重威胁患者的生命安全,该病死亡率较高,我国重症监护病房(intensive care unit,ICU)严重脓毒症的病死率高达48.7%。脓毒症最常见的并发症是急性肺损伤,参与肺损伤的信号通路较多且各个通路之间存在错综复杂的交叉点,目前急性肺损伤治疗效果欠佳,医疗负担也大幅度增加。因此在临床工作中对脓毒症所致的急性肺损伤,早期诊断显得尤为重要。血管内皮细胞损伤在急性肺损伤发病过程中发挥重要作用,血管内皮细胞表面覆盖着一层多糖包被,其核心成分是多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1),在严重感染时极易从内皮细胞表面脱落,导致肺脏血管渗透性增加,在机体保持显性液体正平衡时更容易导致肺水肿甚至出现急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。Wnt5a是(wingless-related integration site-5a)Wnt非经典信号通路的代表蛋白之一,它作为巨噬细胞的效应因子可通过结合不同的Frizzled5受体触发不同的通路,可以通过激活GSK3β后调控NF-κB下游的通路,产生相应的炎症因子。本研究课题拟建立脓毒症致急性肺损伤的动物实验模型,通过研究肺脏的病理改变、肺血管渗透性变化、肺血管内皮细胞病理改变及内毒素处理后小鼠血清标志物Wnt5a、Syndecan-1随刺激时间延长的变化趋势,探讨Wnt5a及Syndecan-1这两种蛋白在脓毒症致急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)动物模型中的表达水平。方法:全部实验过程分为两部分,第一部分:制备脓毒症致ALI小鼠模型,将120只试验小鼠按照随机数字表法分为损伤组和对照组,损伤组予腹腔注射10mg/kg大肠杆菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,血清型:O55:B5),对照组注射等量生理盐水。按肺损伤时间不同分为1h,3h,5h,8h,12h,24h等6个时间点,每组10只,用于研究肺组织病理改变、Wnt5a及Syndecan-1在各组小鼠血清中的表达水平,在不同时间点取全血后保留上清备用;将小鼠麻醉过量致死,开胸后迅速取左肺组织保存待行(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,在光镜下观察小鼠肺组织病理改变;在透射电镜下观察右肺中叶肺血管内皮细胞结构的改变;提取右肺上叶组织蛋白,应用Western blotting检测Wnt5a蛋白的表达水平;取右肺下叶提取组织m RNA,Real-time PCR测定Syndecan-1基因的表达水平;通过ELISA法测定各组小鼠血清Wnt5a、Syndecan-1的浓度变化,观察不同时间点的血清浓度。第二部分:将100只小鼠随机分为损伤组和对照组,应用同样的方法制备动物模型;按肺损伤时间不同分为1h,3h,5h,8h,12h等5个时间点,每组10只,用于研究肺血管渗透性变化,通过尾静脉注射伊文思蓝染液观察肺血管渗透性变化。结果:1.正常组肺组织肺泡壁较薄,肺泡腔内无红细胞及炎性细胞等渗出;随着注射大肠杆菌脂多糖(LPS)时间的延长,肺组织损伤程度逐渐加重。损伤组的肺组织肺泡壁显著增厚,肺泡壁间静脉瘀滞,肺泡腔内大量红细胞及炎性细胞渗出,部分肺泡腔可观察到透明膜形成。2.透射电镜下观察到损伤组血管内皮细胞之间的间距增宽、线粒体出现不同程度水肿、血管基膜与内皮细胞呈不同程度分离,基质出现较多脂质空泡。3.与同时间点对照组相比,损伤组小鼠血清Wnt5a浓度在3h逐渐升高,在5h-8h达峰值,损伤12h后逐渐呈下降趋势,至24h与对照组的差别不明显。4.损伤组小鼠血清Syndecan-1在注射大肠杆菌脂多糖(LPS)3h内维持较高浓度,之后逐渐下降,在8h后稍微回升,与对照组相比较,在24h内均维持较高浓度。5.Western blotting检测Wnt5a蛋白水平,在5h-8h表达量较高。6.Syndecan-1基因在3h表达水平最高。7.伊文思蓝染液在甲酰胺溶液中的浓度随肺损伤程度加重呈升高趋势,在肺损伤5h-8h损伤达峰值。结论:本论文首次探讨了Wnt5a在急性肺损伤动物模型中的表达及浓度变化趋势,通过研究血管内皮细胞多糖包被的核心成分Syndecan-1的浓度变化及伊文思蓝染液渗出浓度来评估在急性肺损伤中肺血管内皮细胞的损伤,通过Wnt5a、Syndecan-1这两项标志物的浓度变化来评估临床急性肺损伤的进程。本研究发现在脓毒症致急性肺损伤早期即可出现血管内皮细胞的损伤,血管渗透功能发生改变,具有一定的临床诊断意义;二者浓度变化与光镜下肺组织的病理改变程度相一致;二者作为脓毒症致急性肺损伤(Sepsis induced-ALI)的早期生物学标志物为临床脓毒症液体管理提供一定指导意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.7

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本文编号：1632173