RGD靶向微泡介导血管内超声评价斑块新生滋养血管

发布时间：2018-04-01 21:21

本文选题：血管内超声　切入点：RGD微泡　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的:急性冠脉事件通常在没有任何预警的情况下导致患者死亡或者残疾,研究显示,易损斑块(vulnerable plaque,VP)是导致急性冠脉事件重要的发病机制。因此,早期准确地识别易损斑块具有十分重要的社会和学术价值。既往研究显示动脉壁及斑块内新生滋养血管与斑块稳定性和心血管事件的发生密切相关。但是目前各种影像技术对新生滋养血管成像存在两方面的不足:一方面滋养血管和斑块内新生血管分子的成像对成像分辨率的要求较高,限制了新生血管分子成像在大动物和人体的应用;另一方面现有影像技术不能区分是成熟滋养血管还是新生滋养血管,缺乏对新生滋养血管的成像特异性。冠状动脉血管内超声(Intravascular ultrasound,IVUS)具有良好的空间分辨率、实时成像等特点,而整合素αvβ3被认为是新生血管标志物,与斑块稳定性具有密切联系。本研究尝试利用含有对αvβ3整合素具有极高亲和力的环状RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸,Arg-Gly-Asp)微泡,进行IVUS超声增强成像,验证RGD靶向微泡介导血管内超声(IVUS)能否通过增强超声灰阶信号反映斑块新生滋养血管密度。方法:1.RGD靶向微泡制备:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、聚乙二醇2000(PEG2000)等脂质材料按一定比例制备成生物素化脂质微泡。再加入抗生蛋白链菌素,室温孵育15min,PBS洗涤3次;然后加入生物素化环状RGD,4°C静置过夜后弃下清液,制备成RGD靶向微泡。同样方法制备生物素化环状RAD(精氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸,Arg-Ala-Asp)同型对照微泡。显微镜下观察两种微泡大小及形态,库尔特计数仪测量RGD靶向微泡与RAD同型对照微泡的平均粒径及浓度。2.实验动物模型及分组:清洁级雄性新西兰大白兔12只购于广东省实验动物中心,体重2.5-3.0kg,随机分成实验组(6只)和对照组(6只)。实验组予以高脂饮食(1%胆固醇,5%猪油,94%基础饲料)喂养2周后,经3%戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉注射诱导麻醉,穿刺右股动脉送入4F动脉鞘,经动脉鞘送入3.5mmPTCA球囊导管至胸主动脉,8-1OkPa压力扩张后,自胸主动脉开始拉动球囊至腹主动脉末端,重复3次,青霉素80万U腹腔内注射3天。对照组6只不做处理。2组均自由饮水,单笼喂养12周。3.IVUS体外成像:3%浓度的琼脂糖溶液500 ml,冷却凝固形成一个具有中空管道的琼脂糖块模型。在中空管道两端连接衔接装置,入口端接蠕动泵,出口端接流出管装置。然后经流出管送入40 MHz IVUS导管探头固定于琼脂模型中空管道中,采用Boston scientific公司iLab IVUS超声机对PBS及RGD靶向微泡进行实时成像,观察微泡体外高频基波成像特点。4.IVUS体内成像:实验动物经3%戊巴比妥钠耳缘静脉诱导麻醉,仰卧位固定于兔台,备皮、消毒、铺巾,暴露左侧股动脉,直视下插入5F桡动脉鞘管,采用Boston scientific公司iLab IVUS超声机,将40 MHz单频IVUS导管送至左肾动脉近心端1 cm处。完全随机顺序注入2mlRGD微泡或RAD微泡,5ml生理盐水冲洗。微泡注入5min后IVUS导管以0.5 mm/s速度机械自动回撤导管至髂总动脉分叉处,图像采集速度为30帧/s,不同微泡间及注射前后增益及滤波条件保持不变。一种微泡注射成像后,体外高机械指数超声彻底破坏微泡,再行另一种微泡成像。IVUS图像脱机分析,分别采用MCE超声彩色编辑软件进行彩色编辑,IPP(Image-Pro Plus)软件分析超声灰度图像,对微泡注入后感兴趣区域平均灰度增强强度(Mean enhancement in region of interest,MERI)值进行分析。5.HE染色及免疫组化:IVUS成像后,经耳缘静脉过量注射3%戊巴比妥钠处死动物,取腹主动脉,固定于4%多聚甲醛,常规包埋切片后行HE染色及αvβ3免疫组化染色,测量微血管密度(Microvascular Vascular Density,MVD)值。6.统计学分析:采用SPSS20.0统计软件进行数据分析,所有数值均用均数±标准差表示,统计学采用两独立样本t检验或单因素方差分析,Bonferroni进行多重比较。P0.05为差异有统计学意义。结果:1.RGD靶向微泡表征库尔特计数仪显示RGD粒径范围约1.76～8.62μm,平均粒径大小约为2.48±0.33μm,浓度约3.65×108个/ml;RAD粒径约为1.84～8.35μm,平均粒径大小约为2.51±0.30μm,浓度约3.37×108个/ml。在普通光学显微镜下可见,RGD与RAD成透亮的微气泡,大小形态均匀,分散良好,未见明显聚集成团现象。2.IVUS体外成像PBS组,血管内超声未见显像;RGD微泡在体外40 MHz基波成像模式下呈散在光亮的点状回声,分布均匀,未见明显聚集成团,显示了良好的声学显影特性。3.IVUS体内成像采用MCE超声彩色编辑软件编辑后,对照组基线水平、RAD微泡及RGD微泡造影成像后,超声信号强度未见明显差异。实验组中RGD微泡造影后,与基线水平及RAD微泡造影成像相比,超声信号明显增强,增强部位主要集中于动脉粥样血管外膜及斑块肩部。IPP软件定量分析MERI显示,对照组中基线水平(10.37±4.32)和RAD(9.99±2.81)、RGD(11.22±4.71)微泡增强相比无差异(P0.05)。实验组中实验组RGD(76.44±31.48)微泡增强后MERI值比基线水平(5.69±4.25)和RAD(7.36±6.18)微泡增强明显升高(P0.01)。4.HE染色及免疫组化HE染色显示,对照组管壁无增厚,平滑肌细胞排列整齐,呈长梭形,实验组可见内膜明显增厚,大量脂质沉积的动脉粥样硬化斑块。αvβ3免疫组化结果显示,对照组未见新生血管形成,实验组内可见大量新生血管,新生血管主要集中于动脉粥样硬化血管外膜及斑块肩部。测量微血管密度(MVD),对照组为0.38±0.26 个/mm2,实验组为 3.96 ±0.84 个/mm2(P0.01)。.结论:RGD靶向微泡介导血管内超声(IVUS)能通过增强超声灰阶信号对反映斑块新生滋养血管密度,有望用于对动脉粥样硬化病变诊断及斑块稳定性的评估。
[Abstract]:Objective : To study the effects of different imaging techniques on the imaging resolution , such as DSPE - PEG2000 - PEG , DPPC , PEG2000 , etc . In order to study the characteristics of high frequency fundamental wave imaging in vitro , a 40 MHz single - frequency IVUS catheter was injected into the hollow conduit of the left renal artery . Results : In the experimental group , RGD ( 76.44 卤 31.48 ) and RAD ( 9.99 卤 2.81 ) , RGD ( 11.22 卤 4.71 ) showed no significant difference compared with baseline ( 5.69 卤 4.25 ) and RAD ( 9.99 卤 2.81 ) . Conclusion : RGD - targeted microbubble - mediated intravascular ultrasound ( IVUS ) is expected to be used to evaluate the diagnosis of atherosclerotic lesion and plaque stability by enhancing the ultrasound gray scale signal to reflect plaque neovascularization .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541.4

【参考文献】