应用MALDI-TOF MS和液相悬浮芯片技术建立一种对沙门菌快速鉴定及血清型分型方法与广州市腹泻患者沙门菌耐药表型和分

发布时间：2018-06-19 06:48

本文选题：沙门菌 + 液相悬浮芯片技术　；参考：《南方医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：沙门菌引起的感染性疾病是一个世界性的健康难题。沙门菌的感染主要来自于被污染的食物和水源,可以引起人类和动物多种疾病,轻者为自愈性胃肠炎,重者可引起致死性伤寒,其引起的疾病主要包括以下几种：胃肠炎、菌血症或败血症、伤寒和副伤寒。沙门菌引起的最常见的疾病是自愈性胃肠炎,其引起的发热在2天之内,而腹泻的持续时间不超过7天。伤寒的典型症状是发热、头痛、腹泻、腹痛并可引起呼吸系统、肝脾和神经系统的损伤等严重并发症。沙门菌为具有鞭毛的革兰阴性杆菌,其抗原结构主要有3种,即菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原及表面抗原(Vi抗原等),当前已发现58种O抗原和114种H抗原。根据沙门菌的O抗原和H抗原的不同,参考Kauffmann-White分型方案,已有超过2500种血清型被发现。不同血清型的沙门菌引起的疾病类型会有所不同,肠热症主要由伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌引起,菌血症或败血症则多数以猪霍乱沙门菌的感染为主。另外,在沙门菌引起的食源性疾病暴发流行中,往往由一种或某几种血清型的沙门菌引发的感染,可根据具体的血清型进行溯源,及早发现疾病暴发流行的源头,阻止其继续传播。因此,对沙门菌血清型进行准确快速分型,有助于临床上对沙门菌病的诊断和治疗,有助于沙门菌引起的爆发流行中的调查研究与控制,并且可用于监控每种血清型的变化趋势。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术,主要是对微生物中的特异性核糖体蛋白进行软电离,形成特定的蛋白指纹图谱,与已建立好的各种微生物的蛋白指纹图谱库进行匹配,从而快速获得鉴定结果。MALDI-TOF MS操作简便,检测快速准确,并且具有高通量检测的优点,目前已广泛应用于临床微生物的病原诊断。液相悬浮芯片技术是一种多功能的液相分析平台,许多反应均发生于悬浮于液相中的微球表面,因而得名,也被称为xMAP (flexible multi-analyte profiling)、液相芯片或者悬浮阵列。xMAP将高通量的生物芯片技术,激光技术、流式细胞术、及应用流体学等技术结合在一起,是一种新型的高通量的芯片检测平台,利用悬浮在液相中的分类编码微球作为检测载体,具有高通量、快速、灵敏度和特异性强及检测范围广的优点。针对沙门氏菌的各种O和H抗原的目的基因片段设计特异性引物,并且设计相对应的特异探针,经多重PCR后,偶联有各种探针的微球与PCR扩增产物进行杂交,然后进行荧光信号检测,从而确定被检测沙门菌相对应的O和H抗原。美国Luminex公司最近开发了Luminex xMAP(?) Salmonella Serotyping Assay (xMAP SSA)试剂盒,可以对沙门菌的血清型进行快速鉴定。该试剂盒在国内外的应用尚处于探索阶段,在国内未见相关报道。本研究包括以下两个部分：一、应用MALDI-TOF MS和液相悬浮芯片技术建立一种对沙门菌快速鉴定及血清型分型方法沙门菌的血清型鉴定长期以来依靠传统的血清学方法,传统的血清学方法需要生产上百种抗血清,并且这些抗血清的生产和使用过程均要进行质量控制。本研究应用MALDI-TOF MS和液相悬浮芯片技术建立一种对沙门菌快速鉴定及血清型分型方法,并且评价该方法对沙门菌鉴定与血清型分型的效能,以及其在中国南方地区的应用价值。收集205株来源于中国南方地区的沙门菌,利用微生物自动生化鉴定系统—Vitek 2和MALDI-TOF MS在属的水平上鉴定沙门菌,然后应用液相悬浮芯片技术—xMAP SSA和传统分型方法同时检测沙门菌的血清型。对于xMAP SSA和传统血清学方法检测不一致血清型的结果,则对相关fljB基因和fliC基因进行PCR和测序分析,进一步判断哪种方法检测的结果是准确的。MALDI-TOF MS在鉴定沙门菌菌属时,与Vitek 2的检测结果完全一致,所有菌株均能准确鉴定到沙门菌菌属。Vitek 2对每个沙门菌菌菌株的鉴定所消耗的时间平均需要5个小时,而MALDI-TOF MS仅需要5分钟左右的时间就可以输出鉴定结果。MALDI-TOF MS可以直接鉴定生长在选择性平板上的沙门菌,而Vitek 2却不能。205株沙门菌中共有40种血清型,数量最多的前5种血清型分别为肠炎沙门菌(Enteritidis)(n=42,20.49%),斯坦利沙门菌(Stanley) (n=32,15.61%), I 4,5,12:i:-(n=29,14.15%),鼠伤寒沙门菌(typhimurimum) (n=24,11.71%),德尔卑沙门菌(Derby) (n=9,4.39%).对205株沙门菌血清型的鉴定中,195株沙门菌的血清型可以被xMAP SSA完全鉴定,有10(4.87%)个菌株的血清型部分的O抗原或者H抗原由于超出本方法的检测范围不能被完全鉴定,xMAP SSA准确鉴定195株沙门菌中的192株沙门菌的血清型(98.5%,192/195),其中仅错误鉴定3株沙门菌的H抗原。传统法对5个没有动力的沙门菌菌株和3个单相型沙门菌菌株均没有完整鉴定出其血清型,但是xMAP SSA可以鉴定出完整的血清型。xMAP SSA不需要相位诱导,且可以进行自动化大批量检测。结合MALDI-TOF MS和xMAP SSA这两种新发展的技术,从沙门菌菌属的鉴定到血清型结果的检测过程比常用的Vitek 2结合传统血清学方法平均可节约79个小时,前者检测一个沙门菌菌株的血清型平均成本费用只是Vitek 2结合传统血清学方法的1/3左右。MALDI-TOF MS结合xMAP SSA鉴定沙门菌血清型的准确率高达98.5%。MALDI-TOF结合xMAP SSA的方法鉴定沙门菌血清型具有准确,快速,高通量和低成本的优点。该方法将会极大地增强临床和公共卫生健康部门对沙门菌血清型分型的能力,十分有助于本地区对沙门菌血清型快速鉴定和监测,并且适用于中国南方地区。二、2013年1月～2014年5月广州市腹泻患者沙门菌耐药表型、PFGE和MALDI-TOF MS分型研究沙门菌是引起食源性疾病的主要病原体之一,可以对人类和动物致病。多年以来,在广州市发生食物中毒的事件中,沙门菌一直占前四位。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术,不仅应用于细菌和真菌的快速鉴定,也逐渐探索其在细菌的种的水平上分型中的应用。为了研究广州市2013年1月～2014年5月腹泻患者感染的沙门菌的血清型分布、耐药情况以及PFGE的分型特征,并且研究MALDI-TOFMS在沙门菌分型中的应用,本研究利用传统血清学方法鉴定沙门菌的血清型,用纸片扩散法(KB法)进行抗菌药物敏感性试验。同时,对82株斯坦利沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和I 4,5,12：i：-四种血清型的沙门菌,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和MALDI-TOF MS进行分型研究。从2013年1月至2014年5月,179株广州市腹泻患者沙门菌的临床分离株被鉴定为38种血清型,数量居前四位的血清型为肠炎沙门菌(21.2%)、斯坦利沙门菌(17.3%)、I4,5,12：i：-沙门菌(16.2%)和鼠伤寒沙门菌(10.1%)。所有沙门菌菌株对萘啶酸、呋喃妥因、四环素、氨苄西林耐药率最高,分别达到44.7%,42.5%,39.7%和35.8%,对环丙沙星的敏感率仅为20.7%；对头孢他啶、头孢噻肟和头孢曲松的耐药率均为7.3%,9.5%和9.5%,对头孢吡肟的耐药率为7.3%。对三类及以上抗生素耐药的多重耐药菌有72(40.2%)株。116株四种常见血清型斯坦利沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和I 4,5,12：i：-沙门菌的多重耐药菌株共有54株,占46.6%。伤寒沙门菌有2株,但是均没有对环丙沙星和头孢类药物表现耐药。不同血清型的沙门菌表现出不同的耐药情况。以相似度90%以上判定为同一型别,27株斯坦利沙门菌、21株肠炎沙门菌、21株鼠伤寒沙门菌和13株I4,5,12：i：-沙门菌分别可分为13、10、11、10个PFGE型与26、20、21、13个MS型。以相似度100%为同一PFGE型,27株斯坦利沙门菌、21株肠炎沙门菌、21株鼠伤寒沙门菌和13株I 4,5,12：i：-沙门菌分别可分为25、15、17和13个PFGE型。从2013年至2014年,在广州市年引起腹泻的沙门菌主要以斯坦利沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和I 4,5,12：i：-沙门菌为主,分成多种PFGE型,呈高度散发的态势。本地区沙门菌菌株的多重耐药现象严重,对于氟喹诺酮类和头孢类药物的耐药性升高,对环丙沙星的敏感性降低。相对于PFGE,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)可以分出更多的MS性,表明MALDI-TOF MS具有更高的分辨能力。利用MALDI-TOF MS对沙门菌进行分型,对沙门菌引起的爆发流行的识别和溯源具有很大的应用前景。
[Abstract]:A novel soft ionization mass spectrometry ( MALDI - TOF MS ) has been developed in recent years . The most common diseases caused by Salmonella include fever , headache , diarrhea and abdominal pain . The invention relates to a novel high - throughput chip detection platform , which combines high - flux biochip technology , laser technology , flow cytometry and application fluidics , and is a novel high - flux chip detection platform . Salmonella Serotyping Assay ( xMAP SSA ) kit can be used for the rapid identification of Salmonella . The results of this study are as follows : 1 . The results of rapid identification and serotyping of Salmonella by MALDI - TOF MS and MALDI - TOF MS . In order to study the serological typing of Salmonella in Guangzhou from January 2013 to May 2014 , the results of MALDI - TOF MS and MALDI - TOF MS were used to identify the serotypes of Salmonella in Guangzhou .
Salmonella typhimurium , Salmonella typhimurium , Salmonella typhimurium and I - 4 , 5 , 12 : i : - Salmonella were divided into 13 , 10 , 11 , 10 PFGE , 21 strains of Salmonella typhimurium and 13 strains I - 4 , 5 , 12 : i : - Salmonella , respectively .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5

【相似文献】