慢病毒介导CX43基因体外转染小鼠骨髓间充质干细胞体系的建立与鉴定

发布时间：2018-08-19 18:39

【摘要】：背景:移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是造血干细胞移植后是影响患者总生存率和生存质量的主要因素。激素是治疗急性和慢性GVHD的一线用药,然而50%患者因对激素治疗无反应而需要二线药物治疗,但由于二线药物缺乏统一标准,不仅导致治疗效果不确定而且药物相关不良反应发生率较高。此外,部分慢性GVHD患者存在激素依赖,而长期应用激素引起的感染、高血糖症、高血压、骨质疏松症和消化系统疾病等,影响着患者的生存质量。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)具有低免疫原性、多向分化潜能、免疫调节特性以及迁移到受损伤组织促进组织修复等特征备受关注,研究显示输注BMSC对激素抵抗型GVHD是有效的,且未发现输注相关不良反应。骨髓造血微环境稳态的维持依赖于骨髓细胞间频繁的信号转导,而以间隙连接蛋白43(connexin 43,CX43)为基础的间隙连接细胞通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是骨髓基质细胞间普遍存在的直接通讯方式。骨髓基质细胞CX43表达的缺陷会影响造血干细胞的植入及化疗后造血的恢复。而白血病造血调控异常极有可能与白血病骨髓基质细胞CX43表达的降低或缺失、GJIC功能下降有关。鉴于此,我们设想通过构建稳定表达CX43基因的BMSC体系,力图为深入探索在GVHD中,CX43基因修饰的BMSC是否会通过增加BMSC间及BMSC与骨髓其他细胞间的信息通讯更好的发挥免疫调节作用提供理论及实验的证据。目的:建立小鼠BMSC体外培养体系,构建CX43基因过表达的重组慢病毒载体并转染小鼠BMSC。以期为探讨CX43基因修饰的小鼠BMSC在GVHD中的作用奠定基础。方法:1.采用全骨髓贴壁分离培养法获取小鼠BMSC,流式细胞术检测细胞表面标志,行成骨、成脂、成内皮细胞诱导分化并分别用茜素红染色、油红染色和免疫荧光及成小管特性鉴定。2.采用限制性内切酶EcoRI/XbaI双酶切含目的基因的质粒和慢病毒载体,再用DNA连接酶将目的基因与线性化的慢病毒载体进行连接,获得重组慢病毒载体,先进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,再对其测序分析,将测序正确的载体和包装质粒共同转染293FT细胞进行病毒包装,收集、浓缩病毒液后用孔稀释法测定其滴度,并采用实时定量PCR对CX43基因表达进行鉴定。然后用重组慢病毒pHBLV~(TM)-CX43-GFP、pHBLV~(TM) GFP感染BMSC,最后采用免疫细胞荧光技术、免疫细胞化学法和Western blot方法检测感染前后CX43蛋白表达的变化。结果:1.经细胞流式鉴定示BMSC表达CD73、CD44、CD29、CD90,不表达CD34、CD105;成骨诱导分化结束后茜素红染色呈红色结节;成脂诱导分化后倒置显微镜下可见明显脂滴经油红染色呈阳性;成内皮细胞诱导分化后经免疫荧光检测示内皮细胞标识CD31、CD34表达明显增加,将细胞接种于Matrigel基底胶上有小管形成。2.琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序分析均证明CX43慢病毒载体构建成功,测定浓缩后病毒滴度为1×108/mL,实时定量PCR鉴定CX43基因在293FT细胞的表达明显增加;采用免疫细胞化学法、免疫细胞荧光技术和Western blot方法测定BMSC的CX43蛋白的表达,结果均显示pHBLV~(TM)-CX43-GFP转染组的CX43蛋白表达高于对照组(P0.05)。结论:1.成功建立了小鼠BMSC体外分离培养体系。2.成功构建了CX43基因过表达慢病毒载体,慢病毒介导CX43基因修饰小鼠BMSC体系的构建成功
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R457.7

【参考文献】