基于LFD-RPA的核酸可视化检测技术的建立及应用

发布时间：2018-10-05 19:49

【摘要】：近年来,随着人们对健康、环境的重视程度越来越高,与生命健康相密切相关各项的病原体检测、产前诊断、遗传病诊断、食品安全检测变得越来越重要,核酸扩增技术(Nucleic acid amplification technology,NAAT)可以从样品中检测出痕量目标分子,具有灵敏特异等诸多优势,已经成为生命科学研究的一个基本和必要的技术手段,并在各个领域中广泛应用,但是传统的扩增技术对实验室、仪器及人员要求较高,快速、便携、可应用于床旁、现场检测(point-of-care testing,POCT)的NAAT相对缺乏。近年来恒温核酸扩增技术的快速发展促进了NAAT技术在POCT中的应用,它不需要高温变性、退火等步骤,对精密仪器依赖程度大大降低,是实现POCT有效的技术手段。其中,重组酶聚合酶核酸扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)相较于其它恒温核酸扩增技术更具有优势,它对样本要求低,可在25-45℃下15分钟内将痕量核酸模板扩增到可检测水平,与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)结合应用形成的LFD-RPA体系能实现肉眼直接判定结果,非常适合资源匮乏地区和野外应用。目前,关于RPA技术的相关研究工作已多有报道,例如手足口病毒、结核分支杆菌、登革热病毒、恶性疟原虫等病原体。以上这些工作都极大的推动了分子诊断技术在POCT领域中的应用。但是,这些工作还存在的一个很大的缺陷就是,他们在从样品准备到结果判定的整个工作中,往往只针对其中的某个环节进行了改进,而没有形成完整的诊断系统,尤其没有完全脱离对电的依赖,限制了其在野外及现场检测中的广泛应用。此外,非封闭操作方式所形成的气溶胶污染也是限制其应用的瓶颈问题。本课题的目标是,构建一种集核酸提取、扩增和结果判定功能的完整的检测系统,不仅能达到简捷、灵敏、特异的检测目的,而且全程不依赖电力,也无核酸气溶胶污染的产生,以更好地为野外及现场检测等POCT应用服务。本研究中,本课题组通过文献调研与预实验,探索构建最佳LFD-RPA反应体系的方法。同时,设计了一个快速、简易、无需加热和离心操作的碱裂解-纸基快速核酸提取装置(Alkaline lysis combined with paper-based filtration isolation of nucleic acid,ALP FINA)和一个能克服LFD-RPA气溶胶污染问题的密闭可视化重组酶聚合酶核酸扩增检测装置(Sealed and visual recombinase polymerase amplification test,SV RPA),将他们组合应用后形成一个具备核酸提取、扩增和结果判定功能的集成化的检测体系。此检测体系可以实现常温下反应,30-40分钟完成整个检测。尤为重要的是,它可以在无电力的环境下应用,非常适用于基层卫生部门,尤其是在野外及现场检测中具有极大优势。本研究将这个能够实现从样本准备到可视化检测的完整的检测体系,应用于日本血吸虫和腺病毒检测,分别针对这两种病原体建立快速、灵敏、特异、可视化的LFD-RPA检测技术,评价其灵敏度与特异性,验证最佳反应温度与反应时间,并利用一定数量的临床样本,对检测体系进行效果评估。具体研究结果如下:一、简易核酸提取方法的建立本研究中建立了碱裂解法结合纸基核酸纯化的ALP FINA样本处理体系,该体系包括过滤器和核酸提取膜,可用于不同类型样本。它利用强碱使细胞膜及核膜迅速破裂,促进核蛋白、核酸酶变性及DNA释放,然后通过fusion 5膜进行纯化。通过与之匹配应用的便携式核酸提取器,可以使整个操作更加便捷、高效,只需向核酸提取器加样口,顺序加入标本与NaOH混合液、无水乙醇及双蒸水,中途无需过柱、离心、加热等烦琐步骤,也无需特殊的仪器设备及电力支持,整个过程只需10-15分钟,且可用于不同类型样本,非常适合现场核酸提取,可直接用于分子诊断和检测实验。二、LFD-RPA最佳检测体系建立方法建立LFD-RP最佳体系的关键是引物及探针的设计。RPA引物设计原则为:引物长度30-35 bp;避免5’端长的G序列,否则会影响重组酶与引物结合;推荐3’端用G、C序列;自由能应低于4 Kcal/mol;在30℃以下不会形成发夹结构。LFD-RPA探针设计原则:长46-52 bp;在距5’端最短30 bp,距3’端最远15 bp处碱基由四氢呋喃(THF)替代;5’端标记FAM荧光基团。三、基于LFD-RPA技术的日本血吸虫检测方法的建立与评价针对日本血吸虫基因组重复序列SjR2设计并选取最佳引物,然后根据引物设计探针,建立LFD-RPA检测体系。经验证,其灵敏度高,可达到5fg/μl,与qPCR结果一致;其特异性好,不会与其它人体寄生虫发生交叉反应;且温度要求低,反应速度快,可以在25-45℃的温度范围内15-20分钟完成。当分别应用酶联免疫检测技术(ELSIA)、间接免疫技术(IHA)及LFD-RPA技术,对14例经金标准法(改良加藤法:Kato-Katz)检测阳性患者及31例北京地区健康志愿者粪便样本DNA进行检测,LFD-RPA检测灵敏度为92.68%,特异性达100%,与金标准法进行Kappa一致性比对时结果为极好(κ=0.947,Z=6.36,P0.001),而ELSIA灵敏度85.71%,特异性93.55,kappa结果为较好(κ=0.793,Z=5.31,P0.001),IHA灵敏度78.57%,特异性83.87%,kappa结果为一般(κ=0.600,Z=4.05,P0.001)。以上结果证明,基于LFD-RPA技术的日本血吸虫检测体系,远优于传统的检测技术。四、基于LFD-RPA技术的B、E型腺病毒检测方法的建立与评价以B、E型腺病毒壳蛋白保守序列为检测靶序列,建立基于LFD-RPA技术的检测方法,此LFD-RPA检测体系可同时检出Adv-B及Adv-E且特异性极佳,不会与其它型别腺病毒及其它病毒发生交叉反应。它的检测灵敏度高,对AdvB及AdvE的检测下限均为10 copies/μl,虽然略低于qPCR(AdvB:5 copies/μl,AdvE:5 copies/μl),但已极为接近足以满足临床需要,且其简便性及快速性远优于qPCR。该检测体系在20℃到45℃的温度范围内均可以有效进行,这样的温度范围意味着该检测体系可以摆脱对加热设备的依赖。另外,通过对RPA的反应时间分析,确定了它可以在10-15分钟内将靶核酸扩增到可检测水平,远快于PCR及免疫学等方法。当对20例阳性和10例阴性临床样本进行检测时,其灵敏度和特异性均达100%。五、密闭LFD-RPA反应装置的研发本研究中研发了一种便携、封闭的SV RPA核酸可视化检测装置,将整个LFD-RPA反应体系整合于此装置内,可使RPA扩增、反应介质递送和LFD检测全过程在同一密闭空间完成,无需开盖,可有效地避免核酸气溶胶污染产生。六、核酸检测完整体系的形成我们将快速简易的核酸提取装置ALP FINA与密闭可视化的SV RPA核酸检测装置组合形成了一个集核酸提取、扩增和结果判定功能的检测系统完整体系,可以实现常温下反应,30-40分钟完成整个核酸检测过程。该系统所具备的特性使之非常适用于基层卫生部门,尤其是在野外及现场检测中具有极大优势。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R440

【参考文献】