【摘要】：我国是抗菌药物的生产和使用大国。抗菌药物广泛应用于医疗卫生、农业养殖领域,在治疗感染性疾病挽救患者生命、防治动物疫病提高养殖效益以及保障公共卫生安全中,发挥了重要作用。但是,由于新型抗菌药物研发能力不足、药店无处方销售抗菌药物、医疗和养殖领域不合理应用抗菌药物、制药企业废弃物排放不达标、群众合理用药意识不高等多种因素,细菌耐药问题日益突出。副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌。弧菌可感染的宿主范围极广包括鱼和甲壳类在内的经济水产动物,同时也是引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,是我国沿海地区食源性疾病的主要病原菌。目前,使用抗菌药物仍然是控制和治疗弧菌病的主要手段,抗生素的过度使用也导致了副溶血性弧菌的耐药性不断增强。近年来,有研究表明外源添加小分子代谢物可以增强耐药迟钝爱德华氏菌对氨基糖类抗生素的敏感性。(1)本研究近一步比较了三种外源物质(葡萄糖、丙氨酸、甘油)对增强副溶血性弧菌抗生素敏感性的作用效果,并采用电子传递链抑制剂CCCP对表型实验结果进行初步验证。(2)基于定量蛋白质组学ITRAQ技术,深入研究细胞代谢微环境与菌体药物敏感性变化机制,为后续复合型抗生素试剂的开发奠定理论研究基础。(3)在基因水平上对蛋白质组学中感兴趣的差异蛋白表达量进行验证。通过数据分析初步表明外源代谢物可通过底物激活,加强菌体细胞内氧化磷酸化水平,显著提高了质子驱动力(Proton motive force,PMF)以及跨膜初级钠泵离子通道草酰乙酸脱羧酶(Oxaloacetate decarboxylase)含量共同促进胞外氨基糖苷类抗生素跨膜运输,从而有效提高了耐药副溶血性弧菌细胞内氨基糖苷类抗生素的有效浓度,提高了细菌对亚抑菌浓度抗生素的敏感性,具有一定的实际应用价值。1.三种外源代谢物对增强副溶血性弧菌抗生素敏感性作用效果的比较本实验在基于耐药代谢状态以及利用原有抗生素来防治多重耐药细菌研究成果的基础上,进一步探究比较了在亚抑菌浓度卡那霉素胁迫条件下,外源添加糖、脂、氨基酸对增强副溶血性弧菌药物敏感性作用效果的影响。实验结果显示,耐药弧菌在分别添加终浓度为10 mM葡萄糖、丙氨酸、甘油后于37°C培养6h,其对1/8MIC卡那霉素药物敏感性分别提高了27000倍,3228倍,102倍。其中以葡萄糖为代表糖代谢途径对提高耐药细菌恢复作用效果较为显著,氨基酸代谢次之,脂质代谢则对能量代谢通路调控能力较弱。并通过偶联剂CCCP对上述实验结果进行了验证。CCCP消除了由外源代谢物代谢所产生的质子跨膜梯度,导致外源代谢物的添加失去作用。通过表型实验初步表明外源代谢物可通过促进氧化磷酸化及跨膜质子动力势产生,刺激了菌体对胞外氨基糖苷类抗生素的吸收。后续进一步的作用机制将在蛋白网络水平上对细菌细胞代谢状态水平的变化进行深入阐释和验证。2.基于定量蛋白质组学ITRAQ阐释外源代谢物对增强副溶血性弧菌抗生素敏感性作用机理研究本次实验首次运用定量蛋白质组学技术深入分析了三种外源代谢物对提高副溶血性弧菌药物敏感性的作用机制。ITRAQ共鉴定出了178个差异蛋白。其中显著表达上调蛋白质(P0.05,ratio1.5)71个,显著表达下调蛋白质(P0.05,ratio0.75)107个。显著的差异代谢通路主要集中在细菌的能量代谢通路、跨膜蛋白转运体和阳离子通道、信号转导、DNA损伤修复及细胞凋亡等相关生物过程。其中糖代谢通路上丙酮酸脱氢酶PDH、柠檬酸合酶Glt A、酮戊二酸脱氢酶复合体-亚基OGD、琥珀酰辅酶合成酶β亚基SucC、琥珀酸脱氢酶SDH表达量均有明显提高。氨基酸代谢通路富集到的差异主要集中在天冬氨酸-精氨酸合成代谢、甘氨酸和丙氨酸等代谢通路。已知氨基酸代谢在调控胞内pH,产生代谢能量或还原力以及调节胞内微环境稳态方面有重要作用,而无氧呼吸过程相关的乳糖代谢通路中关键酶乳糖脱氢酶和细胞分裂因子则受到显著抑制。其中有趣的是草酰乙酸脱羧酶作为主要的初级Na+泵离子通道其含量发生显著的变化。草酰乙酸脱羧酶(Oxaloacetate decarboxylase,Oad)是一个多酶复合体,由α亚基(Oad A,63-65KDa),β亚基(OadB,40-45Kda),γ亚基(OadG,9-10KDa)组成,该多酶复合体三个亚基蛋白表达量均显著上调,从差异蛋白交互作用分析得出草酰乙酸脱氢酶作为嗜盐菌中重要的阳离子跨膜通道(嗜盐菌中重要的物质运输交换通道之一),其活性亚基OadG与糖酵解中关键限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶pck A互作关联紧密,与天冬氨酸与精氨酸合成代谢以及引发SOS易错修复阻遏蛋白lexA和主要的DNA修复酶—DNA聚合酶IV dinB存在显著的互作关系,该酶氧化脱酸产物α-酮戊二酸可进入菌体主要能量代谢通路柠檬酸循环,水解产生的能量可促使胞内Na+外排产生的阳离子动力势促进胞外溶质的吸收。从通路富集结果猜测嗜盐类海洋弧菌可通过氧化磷酸化产生的质子动力势并偶联草酰乙酸多酶复合体组成的初级钠泵离子通道促进胞外氨基糖苷类抗生素的跨膜运输,有效提高了胞内抗生素的有效浓度。为杀死多药耐药副溶血性弧菌提供了新思路,也为复合型抗生素新药开发奠定了理论基础。3.基因水平上对相关差异蛋白的表达验证为了进一步验证添加外源代谢物对菌体蛋白的影响并进一步验证基因表达量与蛋白表达量之间的关系,选取通路中9个重要的差异蛋白通过qRT-PCR对其基因表达量进行定量验证。实验结果表明通路上基因的表达量变化趋势与蛋白含量变化趋势相吻合。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5
【参考文献】
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2352986
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