糖皮质激素受体在大鼠神经病理性疼痛早期脊髓小胶质细胞中的作用

发布时间：2019-01-30 09:08

【摘要】：背景神经病理性疼痛(Neuropathicpain,NPP)定通常指中枢或外周神经系统的损坏及功能失调引起的异常疼痛,NPP属于慢性疼痛的一种,主要临床表现为痛觉过敏、感觉异常、自发性疼痛和异常疼痛等。其发病率高,疼痛治疗的整体效果不佳,因此探究神经性疼痛的发病机制,为疼痛治疗提供可靠依据将具有重要医学价值。糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)是重要的核转录因子。GR激活后进入细胞核内与特定的DNA序列(糖皮质激素反应元件)结合在一起,进而正调控或负调控靶基因的表达,参与不同的生物效应和多种生理、病理过程[1,2]。近年来,越来越多证据表明中枢糖皮质激素受体GR可能参与中枢痛敏形成及伤害性信息的传递,但具体机制不明确[3,4]。众所周知,中枢活化的小胶质细胞通过合成与释放疼痛及炎性相关介质(如COX 2、IL-6、TNF-α等),作用于神经元或者邻近的胶质细胞,近而增强痛觉传递神经元敏感性和反应性,引发持续性的神经病理性疼痛。已有报道证实GR广泛表达与中枢神经系统,并且可参与免疫炎症反应,那么神经病理性疼痛中,GR与活化的小胶质细胞中有怎样的作用关系呢?研究发现神经损伤诱发的异常性疼痛依赖于p38 MAPK信号通路,并且活化的p38 MAPK仅表达在激活的小胶质细胞[5]。本实验拟通过坐骨神经分支选择性损伤模型(sparednerve injury,SNI)早期鞘内给予p38 MAPK抑制剂,检测神经病理性疼痛中小胶质细胞p38 MAPK信号通路对GR的调控。然后再给予GR的抑制剂,用于探索GR对下游转录因子核因子κB(NF-κB)及促炎因子的调控。由此重点研究GR参与神经损伤诱导的神经病理性疼痛的发生发展的分子机制,为神经病理性疼痛的治疗提供新的实验依据。目的(1)建立SNI大鼠神经病理性疼痛模型,观察SNI术后大鼠脊髓机械痛行为和脊髓GR蛋白表达变化。(2)通过蛛网膜下腔注射SB203580阻断p38MAPK通路,利用RU38486抑制掉GR的功能,分别检测给药后机械痛行为和GR、磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表达变化。以此探索神经病理性疼痛中p38MAPK信号通路通对GR和p NF-κB的调控。(3)鞘内给予GR的激动剂DEX,检测SNI大鼠痛行为的变化及p NF-κB表达变化,进一步验证在神经病理性疼痛中GR对下游转录因子NF-κB的调控。材料和方法(1)建立SNI大鼠动物模型[6],检测模型的成功及大鼠脊髓GR蛋白变化将实验用大鼠按照随机表法分组,每组12只:正常组(normal组),手术模型组(SNI组),假手术对照组(sham组),SB203580注药组(SNI+SB203580组),单纯溶质组(SNI+Vehicle组,n=12);假手术注射溶剂组(sham+Vehicle组),模型组给予溶剂组(SNI+Vehicle组,n=10)SB203580和RU38486联合注药组(SNI+SB203580+RU38486),地塞米松处理组(SNI+DEX组)。手术组剥离皮下组织,使坐骨神经及三个分支充分暴露,分别从两端结扎腓总神经、胫神经并剪掉两个结扎位点中间部分。sham组只暴露坐骨神经,而不做结扎处理。Von frey检测大鼠机械痛时程变化,确定模型成功;酶联免疫吸附检测(ELisa)检测大鼠血浆皮质酮的变化;Western-blot检测大鼠脊髓GR、磷酸化p38(p-p38)和磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表达;免疫荧光化学检测脊髓GR与小胶质细胞标记物是否共标。(2)检测神经病理性疼痛中p38对GR的调控术后早期通过蛛网膜下腔注射SB203580阻断p38MAPK通路,检测对大鼠机械痛行为影响;Western-blot和免疫荧光技术检测下游转录因子p NF-κB表达变化;ELisa检测大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α的变化。在此基础给予RU38486抑制掉GR的功能,观察该现象是否被GR受体阻滞剂RU38486逆转。(3)检测神经病理性疼痛中GR对磷酸化NF-κB的调控SNI术后立即通过蛛网膜下腔注射DEX激活GR的表达,检测机械痛行为及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的变化,行为学观察激活GR后是否逆转了神经损伤诱导的痛行为,Western-blot和ELisa分别检测p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的改变。结果1.SNI动物模型制作成功。与sham组相比,SNI模型组大鼠术后3d、7d、14d、21d和28d时间点,机械痛阈降低,模型建立成功。Western-blot检测与sham组相比,SNI组脊髓GR表达逐渐降低,p-p38和p NF-κB表达增加。免疫荧光双标技术检测GR在小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞均有表达。2.Western-blot,免疫荧光结果显示:SNI大鼠术后立即连续7 d鞘内注射SB203580后,大鼠脊髓p-p38、p NF-κB表达降低,而GR表达水平提高,Elisa检测到血清促炎因子水平降低;而鞘内注射RU38486抑制GR的表达,结果逆转了SNI+SB203580组疼痛缓解的局势及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α高表达的现象。3.SNI大鼠于术后早期鞘内注射DEX上调GR的表达,结果显示与未给药SNI组相比,SNI+DEX组大鼠疼痛缓解,脊髓p NF-κB的表达增高,促炎因子IL-6、TNF-α的表达降低。Western-blot,免疫荧光结果显示GR负调控p NF-κB的表达。结论1.在神经病理性疼痛的早期中,脊髓小胶质细胞p38MAPK信号通路活化通过下调GR的表达促进疼痛的发生、发展。2.在神经病理性疼痛中,激活的GR能够通过抑制脊髓NF-κB的磷酸化及促炎因子IL-6和TNF-α的表达水平而缓解疼痛。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R402

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本文编号：2417977