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基于靶向诱导DNA纳米自组装生物传感策略及其简单快速核酸检测应用研究

发布时间:2019-02-23 15:22
【摘要】:快速、灵敏、高特异核酸检测在传染性、遗传性及基因疾病诊断中起着十分重要的作用。即时核酸检测是在患者身边,由非检验专业人员利用直接进行患者标本分析,无需复杂实验室操作的一项新技术,以其操作简便、迅速、成本低,以及便携等优点受到广泛的关注。众所周知,临床样本具有复杂的生物化学性质,且检测的目标核酸丰度较低,因此增加了传感策略在实际标本检测中的应用难度。近年来,研究者们将DNA纳米自组装策略与核酸检测相结合,实现了简单快速核酸检测应用。本研究以核酸为检测目标,结合靶向诱导的DNA纳米自组装策略及等温扩增技术,为快速高灵敏的即时核酸检测提供了技术支持。研究内容分为以下两部分:1.基于缺陷T型DNA结构介导转录扩增的电化学传感器及其即时核酸检测应用本项目设计了一种基于缺陷T型DNA结构介导体外转录的信号放大转化策略,等温条件下将均相稀有的靶基因特异识别事件转化为短链RNA的大量扩增,并在同一传感体系完成固相电化学检测。特殊设计的缺陷T型结构可进一步降低方法的背景信号,提高灵敏度,实现靶基因的等温、快速、超灵敏检测。所建立的传感器检测B族链球菌(GBS)致病基因的线性范围为1 f M-1 n M,最低检测限为0.4 f M;而且,可免PCR直接检测低至104 CFU m L-1 GBS菌,相当于能直接检测400个细菌。用于20例临床实际样品检测,与CFDA批准的荧光PCR试剂盒检测结果完全一致(P≤0.05),且DPV峰电流与Ct值具有很好相关性。基于缺陷T型DNA结构介导转录扩增的电化学传感器将均相靶分子识别、信号扩增转化、固相传感整合到同一检测体系,实现靶DNA的等温、快速、超灵敏检测;并成功用于临床实际样品中GBS的现场快速鉴定;为即时核酸检测提供了新的技术支持。2.基于量子点表面DNA纳米自组装和双重荧光淬灭的超灵敏Micro RNA传感器基于量子点的荧光能量转移在细胞成像、生物传感、临床诊断等领域具有广阔的应用前景。但现有的传感策略灵敏度相对较低、检测步骤较多。本项目利用靶分子诱导量子点表面的DNA纳米自组装;在量子点表面引入大量G-四链体,并建立G-四链体/hemin诱导量子点的双重荧光淬灭机制。该双重荧光淬灭机制包括(1)hemin作为受体的光诱导电子转移;(2)G-四链体/hemin作为HRP模拟DNA酶,在量子点表面催化原位产生新生态O2,进一步淬灭量子点荧光。由此建立micro RNA(Mi RNA)简单、超灵敏检测新策略。该策略检测Mi RNA-21的线性范围为100 f M-10 n M,最低检测限为37 f M;相较于只引入hemin作为受体的光诱导电子转移的检测体系,检测限降低了1000倍。而且可在1小时内完成检测过程。在乳腺癌细胞MCF-7的总RNA提取样品中,可在870 ng的总RNA中可检测到66 amol的Mi RNA-21,且具有很好的检测重复性和准确度。基于靶向诱导的量子点表面DNA纳米自组装和DNA酶介导的双重荧光淬灭的生物传感策略,实现Mi RNA的等温、快速、超灵敏检测;并成功用于实际样品中Mi RNA-21快速灵敏检测;为方便、快速核酸检测提供了新的技术支持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TP212.3;R440

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本文编号:2428953

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