烧伤创面脓毒症小鼠创面和免疫组织中树突状细胞及细胞因子变化的实验研究

发布时间：2020-03-18 23:27

【摘要】：背景与目的:脓毒症是严重烧伤后常见的并发症和死亡原因之一,是危重烧伤临床救治的难点和重点。创面感染是引发烧伤脓毒症的首要原因:烧伤后皮肤这一保护屏障被破坏,微生物从创面入侵,坏死组织又为病原体提供了适宜的生长环境,使创面易于发生侵袭性感染,进一步加重即可引发脓毒症。研究证实烧伤脓毒症的发生率和病死率与创面大小和烧伤程度明显相关。在脓毒症早期,炎症与免疫反应异常主要表现为全身过度炎症反应,“炎症风暴”所引起的组织坏死和器官功能障碍其主要死因。脓毒症后期免疫状态逐步转变为以抗炎反应为主的代偿性抗炎反应综合症和免疫抑制,机体易于发生继发感染和二次损伤,这也是脓毒症后期患者的主要死亡原因。因此,创面炎症反应和机体免疫状态在烧伤脓毒症的治疗和预后中有关键的作用。树突状细胞(DCs)是体内唯一能激活初始T细胞的专职抗原提呈细胞,在皮肤组织中定居着多种DCs亚群。已有研究证实,脓毒症可导致DCs数量和功能上的改变,是造成免疫抑制重要组成部分。但是目前,国内外鲜见关于烧伤创面和免疫组织中的DCs及细胞因子的变化及其与机体免疫状态关系的报道,本课题将针对该问题进行实验性研究,为烧伤创面脓毒症的创面治疗和免疫状态调节提供帮助。方法:1.动物分组及处理:将8~12周的雄性SPF级BalB/c小鼠随机分为三组,对照组(sham:背部20%TBSA皮肤37℃水浴接触9s)、烫伤组(burn:背部20%TBSA皮肤90℃水浴接触9s)、烫伤感染组(sepsis:背部20%TBSA皮肤90℃水浴接触9s,创面冷却后在创面中心皮下注射铜绿假单胞杆菌1×10~6CFU/ml菌液50ul)。2.观察三组小鼠外观和行为特征,每24h记录一次小鼠的生存率,记录一周;每24h记录一次小鼠的体重,记录96h。3.分别检测三组小鼠外周血血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐、血清尿素氮的含量,对比三组小鼠的肝肾功能。4.分别取三组小鼠的脏器组织(心脏、肝、脾、肺、肾),碾磨后离心取上清液,按1:10比例稀释后吸取100ul稀释液均匀涂抹在血培养板上,37℃孵箱内培养24h后取出,双人独立计算菌落形成数量并记录结果。5.取三组小鼠的背部创面及其边缘皮肤组织做组织学观察。6.分别于24h、48h、72h取三组小鼠的创面皮肤组织、肝脏、脾脏,采用RT-PCR检测上述组织中IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α的mRNA表达量。7.分别于24h、48h、72h取三组小鼠的外周血、创面皮肤组织、脾脏、淋巴结(双侧腋下及双侧腹股沟淋巴结),制备单细胞悬液,采用流式细胞分析术检测上述组织中CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、CD11c~+DCs、CD11c~+CD86~+DCs的比例。结果:1.烫伤感染组小鼠的一般状况、自主活动和对外界刺激的反应较对照组和烫伤组明显较差;体重持续明显下降,在72h下降了约13%;死亡率高达60%~80%。其他两组的一般状况良好,体重稳定,死亡率也未见异常。2.烫伤感染组表皮有大量坏死物附着,毛囊等皮肤附属器基本坏死;真皮层胶原纤维排列紊乱,大量空泡形成;皮肌层肌纤维横纹大量消失,细胞崩解坏死明显,大量多形粒细胞浸润。3.烫伤感染组各脏器内的细菌定量均明显高于其他两组,差异具有明显的统计学意义,其中脾脏的细菌含量最高,约为含量最低的心脏结果的10倍,对照组和烫伤组小鼠的脏器细菌定量水平较低。4.烫伤感染组小鼠的肝肾功能明显下降,肝功能指标ALT升高至对照组的3~4倍,AST为对照组的2~3倍,肾功能指标BUN、Scr均升高至对照组的2~3倍。5.烫伤感染组小鼠组织中的细胞因子mRNA表达量均有显著升高,其中IL-6、IL-12、TNF-α、IL-15的表达水平在48小时内上升明显,与对照组有显著差异,IL-6在脾脏的表达水平为对照组的5倍,在皮肤的最高可达对照组的10倍。IL-10在创面组织和肝脏组织中的表达水平持续增加,约为对照组的2倍,在脾脏组织中的表达水平较为稳定,约为对照组的3倍。6.在烫伤感染组小鼠外周血、脾脏和淋巴结中的的T细胞比例均出现明显下降,CD4~+T细胞/CD8~+T细胞比值均有持续减小的表现,在72h达到较低水平。烫伤组的T细胞比例介于其他两组之间,CD4~+T细胞/CD8~+T细胞比值未见明显变化。烫伤感染组的创面皮肤组织中T细胞的比例持续增加,显著高于对照组,CD4~+T细胞/CD8~+T细胞比值在24h达到最大值,约为对照组的两倍,在48h和72h持续降低,与对照组无统计学差异。烫伤组的T细胞持续升高,但均低于烫伤感染组,CD4~+T细胞/CD8~+T细胞比值无明显变化。7.烫伤组和烫伤感染组的外周血中树突状细胞比例均持续下降,且烫伤感染组下降更加明显,两组与对照组的差异均有统计学意义。CD86~+树突状细胞比例在24h和48h均高于对照组,48h高达30%,在72h降至20%。烫伤组和烫伤感染组创面皮肤中的树突状细胞的比例均持续升高,差异均有统计学意义,CD86+树突状细胞的比例变化规律与外周血一致,在48h达到最高,在72h降至较低水平。在烫伤感染组脾脏中的树突状细胞在24h和48h均高于对照组,72h降低与对照组无统计学差异,CD86~+树突状细胞的比例在24h最高,约为30%,在72h降至20%以下。烫伤感染组淋巴结中的树突状细胞比例均低于对照组,且差异均有统计学意义,而CD86~+树突状细胞的比例也在持续减小,在48h和72h均明显低于烫伤组和对照组。结论:1、本实验建立的烧伤创面脓毒症小鼠模型稳定有效。2、烧伤创面脓毒症小鼠早期创面炎症反应发展迅速包括细胞免疫和非特异性免疫反应,48h后出现细胞免疫减弱,树突状细胞分化障碍,促炎因子表达水平下降,而抗炎反应持续增强。3、烧伤创面脓毒症小鼠脾脏组织中的细胞免疫在在24h和48h较为稳定,72h后出现明显的细胞免疫障碍,而树突状细胞的分化障碍在48h已经出现。
【图文】：

平均体重,小鼠,小鼠毛发,创面

第 3 章结果第 3 章结果情况般情况组：小鼠毛发光亮，，活动敏捷，对外界刺激反应灵敏，饮食饮小鼠毛发光亮，活动减少，对外界刺激的反应正常，创面逐偶有少许暗红色斑点分布，创面周围无明显肿胀，饮食饮水：小鼠毛发无光泽，活动明显减少，活动的姿势异常，呈蜷缩激反应迟钝，创面为暗红色痂状，创周皮肤肿胀，饮食饮水明重

生存率,小鼠

三组小鼠的生存率结果
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7

【参考文献】