树状大分子修饰的PLGA纳米纤维基用作基因传递系统的研究

发布时间：2020-03-19 00:11

【摘要】：基因治疗是一种新型的、通过操控相关遗传物质来阻碍疾病的发生和发展,进而达到治疗目的的医疗手段。而目前基因治疗最主要的困难就是缺少一种安全有效的传递表达载体,因为裸露的基因治疗药物(具有特异性表达的DNA质粒)在组织或细胞中易被核酸酶降解,而且其自身所带负电荷与同电荷性质的细胞膜之间相互排斥,导致其被细胞内吞和在内涵体中的逃逸能力差,使得基因治疗难见成效。静电纺丝技术可以连续性高效制备超细纤维,利用静电纺丝制备的纳米纤维毡具有均匀多孔结构、比表面积高等优点,其独特的3D结构可以很好地仿生天然细胞外基质,为细胞的营养物质交换及繁殖提供良好的微环境。过去,静电纺丝技术制作基因载体的普遍方法是把具有生物相容性的高聚物溶液与基因药物直接混合在一起进行纺丝,成丝过程中基因药物必定会暴露在高压电场和有机溶剂环境中,这一定会影响基因药物的生物活性。另外,单纯混合纺成的电纺纤维载体中的基因药物由于分布不匀,包封不完毕,当进行体外释放时存在突释效应。树状大分子是一种内部含有空腔、表面具有大量活性官能团的高度对称性球形大分子,且表面端基的数量随着其代数的增加而呈指数级增长。由于其表面正电荷密度高,能有效压缩基因治疗药物且在细胞内涵体内具有极强的质子缓冲能力而被用作非病毒性基因输送载体的典型。考虑到现有静电纺纳米纤维基介导的基因转染体系中存在的问题,结合树状大分子作为基因输送载体的优势,本实验首次提出将端氨基第五代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH_2)固定在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维表面来原位压缩增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因,并以固定了纳米G5.NH_2/pEGFP复合颗粒的纤维基体作为细胞培养支架,构建一种原位、局部基因转染的复合基质介导传递体系。首先,本文采用自制的静电纺丝装置,研究了PLGA的浓度和纺丝流速对纳米纤维成丝性能的影响,发现在PLGA浓度为25 wt%、纺丝流量为1 ml/h、施加电压为20 kv的条件下能纺出粗细均匀、直径较小、形貌可观的纳米纤维。然后,采用层层自组装的方法,将端氨基第五代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)固定在PLGA纳米纤维的表面形成纤维基复合基因输送体系。扫描电子显微镜(SEM)显示纤维表面形态及三维多孔结构并未发生明显变化,但纤维平均直径有所增加;X射线光电子能谱(XPS)证实在修饰了G5.NH2后谱图中出现了明显的氮元素的特征峰,而氮元素的出现证明G5.NH2成功修饰至纤维表面,且修饰效率随PDADMAC/PAA组装层数的增加有所提高。亲疏水性测试说明材料经组装、修饰处理后亲水性能得到较明显的改善。后续的原子力显微镜(AFM)检测则显示G5.NH2的成功修饰可以大大提高PLGA纳米纤维表面的粗糙度,也印证了由于粗糙度的增加,修饰处理后的PLGA纳米纤维亲水性能得到的改善。最后,选取成纤维细胞NIH 3T3为模型细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒DNA为模型基因药物,评价负载了模型基因的纳米纤维对细胞的原位基因转染效率。荧光显微镜和流式细胞仪分别定性和定量的分析了复合纳米纤维基的转染效率,说明组装两层PDADMAC/PAA的PLGA复合纳米纤维基具有更高的基因转染效率,达到了3.76%。
【图文】：

基质,纳米纤维,细胞,基因转染

图 1.1 细胞镶嵌在静电纺纳米纤维支架中生长接包裹在基质中用于基质介导基因转染，常也很差。通常在 DNA 被基质负载之前，，能有效保护 DNA 免受核酸酶的降解并提03 年，M.Hadjiargyrou 所领导的研究团队段共聚物（poly (D,L-lactide)-poly(ethylen载有基因的复合颗粒，再与纺丝液 PLGAA 负载在纳米纤维中[6]。初步试验结果证天，而且释放时间可以通过改变共聚物各组够转染培养皿中培养的小鼠成骨细胞（M模式使得转染效率较低。而将细胞直接在载所处微环境的局部基因药物浓度得到提高基质介导的局部基因转染的潜力。体

脂质体,结构式,细胞毒性,缩合

图 1.2 几种已商业化的脂质体结构式合物物也是一种较为普及的转染试剂，对 DNA 具有很好的缩合、包覆和运体内转染应用中不会像脂质体那样有较高的细胞毒性，因而对其的研究
【学位授予单位】：武汉纺织大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R450;TQ340.64

【参考文献】