以整合素αv亚基为靶点干预放射性肺纤维化的作用和机制研究

发布时间：2020-03-19 04:07

【摘要】：第一部分以整合素αv亚基为靶点干预放射性肺纤维化的动物水平研究目的放射性肺纤维化是胸部放射治疗的常见并发症,目前仍缺乏有效的预防和治疗手段。因此,针对放射性肺纤维化的研究具有重要临床意义。TGF-β1是调节肺纤维化的关键因子,肌成纤维细胞是调控肺纤维化的关键细胞。研究表明肌成纤维细胞表达的整合素αv介导的TGF-β1活化在肝纤维化和肾纤维化中具有重要作用,而整合素αv在放射性肺纤维化中的作用尚无报道。本研究将探讨以整合素αv亚基为靶点干预放射性肺纤维化的可行性。方法利用Pdgfrb-Cre转基因小鼠靶向肌成纤维细胞,构建Itgav~(loxP/loxP);Pdgfrb-Cre肌成纤维细胞整合素αv条件性敲除小鼠。给予上述转基因小鼠和野生型小鼠胸部单次16Gy照射,照射后第24周通过肺组织HE染色、Masson染色、Ashcroft纤维化评分、小动物活体CT成像、羟脯氨酸测定、组织蛋白免疫印迹分析等方法比较基因敲除型和野生型小鼠肺纤维化程度。结果野生型小鼠相比,基因敲除小鼠放射性肺纤维化程度显著减轻。具体表现为与野生型小鼠相比,Itgav~(loxP/loxP);Pdgfrb-Cre基因型小鼠保有较为完整的肺组织形态结构、Ashcroft纤维化评分较低(p0.01)、胶原沉积较少、羟脯氨酸含量较低(p0.05)、α-SMA表达水平较低,且差异具有统计学意义。结论敲除肌成纤维细胞整合素αv基因可显著减轻小鼠放射性肺纤维化,为临床上以整合素αv亚基为靶点干预放射性肺纤维化提供了理论依据。第二部分整合素αv亚基通过激活TGF-β1及其下游通路促进放射性肺纤维化目的我们通过建立ItgavloxP/loxP;Pdgfrb-Cre条件性基因敲除小鼠放射性肺纤维化模型,发现肌成纤维细胞表达的整合素αv是放射性肺纤维化病理过程中的关键蛋白。研究表明,整合素αv在TGF-β1的活化中起关键作用。然而,整合素αv是否通过激活TGF-β1促进放射性肺纤维化的发生尚不清楚。本研究将进一步探讨整合素αv在放射性肺纤维化中的作用机制。方法应用ELISA方法测定整合素αv敲除型和野生型小鼠血浆TGF-β1水平,比较照射前后血浆TGF-β1水平变化。以8Gy照射MRC-5细胞,比较照射前后整合素αv、TGF-β1下游Smad通路蛋白和纤维化指标的表达变化。应用外源性RGD多肽、TGF-β1和基因敲低技术,明确整合素αv对TGF-β1的激活作用及其作用机制。结果照射组小鼠血浆总TGF-β1水平均较对照组升高,且整合素αv敲除型与野生型小鼠两组间无明显差异。而照射组中敲除型小鼠血浆活化型TGF-β1水平较受照射的野生型小鼠明显降低。MRC-5受照射后整合素αv、磷酸化Smad2/3、α-SMA和胶原的表达均上调。利用外源性RGD多肽或整合素αv基因敲低处理MRC-5可逆转上述现象,导致蛋白表达的下调。进一步使用外源性活化型TGF-β1处理细胞,可逆转外源性RGD多肽或整合素αv基因敲低所导致的蛋白表达下调,而使用外源性潜在型TGF-β1处理细胞无此作用。结论整合素αv通过与RGD序列作用激活潜在型TGF-β1,从而促进放射性肺纤维化的发生。第三部分整合素基因单核苷酸多态性与放射性肺损伤的相关性研究目的放射治疗在肺癌治疗中具有重要地位。作为辐射诱导的正常组织并发症,放射性肺损伤是胸部照射剂量的主要限制性因素。然而,即使放射治疗的剂量学参数相同,患者发生放射性肺损伤的几率和程度存在较大个体差异,这意味着遗传因素可能在放射性肺损伤的发病中具有重要作用。基于前两部分的研究,本部分将进一步在人体水平研究整合素基因单核苷酸多态性与放射性肺损伤的相关性,并建立放射性肺损伤预测模型。方法在接受放射治疗的肺癌患者人群中,应用质谱和一代测序技术对患者整合素基因单核苷酸多态性进行分型。应用Cox回归生存分析研究整合素基因型与放射性肺损伤的相关性,应用Kaplan-Meier曲线描述联合剂量学参数不同rs4665162基因型患者的放射性肺损伤发病风险和时间的函数关系。应用免疫组织化学分析技术比较不同基因型患者整合素蛋白表达水平的差异。根据整合素基因型、剂量学参数等因素与放射性肺损伤的相关性,建立放射性肺损伤预测模型,应用ROC曲线比较各模型的敏感度和特异性。结果Cox回归生存分析发现患者年龄、照射方式、V20、MLD以及整合素rs4665162基因型与放射性肺损伤发病风险存在相关性。rs4665162 AG/GG基因型联合剂量学参数MLD≥13.5Gy或V20≥24.1%以及未接受IMRT的患者具有最高的放射性肺损伤发病风险。免疫组织化学染色发现AG/GG基因型患者肺组织中整合素表达水平更高(p0.05)。与单纯剂量学参数预测发病风险相比,联合患者年龄、MLD、IMRT、rs4665162基因型等因素建立的放射肺损伤预测模型ROC曲线下面积最大,即具有最好的敏感度和特异性。结论整合素rs4665162基因型与放射性肺损伤发病风险存在相关性,联合患者年龄、MLD、IMRT、rs4665162基因型等因素建立的放射性肺损伤预测模型具有较好的敏感度和特异性。
【图文】：

转基因小鼠,构建模式,基因型,序号

华中科技大学博士学位论文结果1. ItgavloxP/-转基因小鼠的构建如图 1 所示，构建得到 ItgavloxP/-转基因小鼠。PCR 验证目的小鼠的基因分型：使用 mItgav_F1 和 mItgav_F1 引物的 PCR 得到的条带中 199bp 基因型为野生型，260bp基因型为 loxP site，，可见序号 25、26、27 含有 loxP 基因片段（图 2A）；使用 mItgav_F2和mItgav_F2引物的PCR得到的条带中203bp基因型为野生型，343bp基因型为Frt site和 loxP site，进一步验证序号 25、26、27 含有 loxP 基因片段（图 2B）；使用 mItgav_F3和 mItgav_F3 引物的 PCR 得到的条带中 3.3kb 基因型为 loxP site 和 Exon of Gm13684，进一步验证序号 25、26、27 含有 loxP 基因片段（图 2C）。

PCR鉴定,基因,小鼠

ftgav0"P}一转基因小鼠PCR鉴定结果
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R730.55

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