肺炎克雷伯菌生物膜形成与外排泵基因的相关性研究

发布时间：2020-03-22 07:40

【摘要】：目的本课题拟探讨肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与耐药的相关性,多重耐药肺炎克雷伯菌外排泵基因的分布情况以及外排泵基因acrA在生物膜内的表达情况,以及外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙(carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone,CCCP)对肺炎克雷伯菌生物膜形成影响。深入了解肺炎克雷伯菌生物膜耐药机制,为有效防控肺炎克雷伯菌感染提供科学依据。方法1.收集西南医科大学附属医院2017年1月至2017年6月临床感染患者样本中分离的61株非重复肺炎克雷伯菌。利用MicroScan WalkAway 96 Plus全自动微生物鉴定/药敏测试系统进行鉴定,对标本来源和科室分布进行分析,并分析其耐药谱。2.结晶紫染色法和共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)法评价肺炎克雷伯菌形成生物膜能力,分析肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的强弱与耐药的相关性。3.随机抽取16株生物膜形成能力不同的菌株,绘制肺炎克雷伯菌生物膜生长曲线,微量肉汤稀释法检测这16株菌对头孢吡肟、阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、多粘菌素B最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)以及最低生物膜清除浓度(Minimal biofilm eradicate concentration,MBEC),分析MIC、MBEC与其生物膜形成能力的相关性。4.用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术检测28株多重耐药肺炎克雷伯菌外排泵基因acrA、emrB、oqxA、qacEΔ1携带情况,并运用(reversetranscription-PCR,RT-PCR)技术分析acrA基因阳性菌株在生物膜状态和浮游状态的表达情况。5.结晶紫染色法分析不同浓度的外排泵抑制剂CCCP对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响。结果1.61株肺炎克雷伯菌临床分离菌株中,主要来自于血液34株,占55.74%,其次是痰16株,占26.22%,分泌物8株,占13.11%,尿液3株,占4.92%。临床科室分布以ICU病房检出率最高,为21.31%,其次是呼吸科病房,检出率为13.11%。检出多重耐药肺炎克雷伯菌(Multi-drug resistant acinetobacter klebsiella pneumoniae,MDR-Kpn)28株,检出率为45.9%(28/61),非多重耐药菌33株,检出率54.1%(33/61)。MDR-Kpn对包括氨苄西林、头孢唑林等13种抗菌药物耐药率在50%以上,仅对美罗培南,亚胺培南,厄他培南,阿米卡星和头孢哌酮/舒巴坦耐药率低。将MDR-Kpn(n=28)与非MDR-Kpn(n=33)两组对23种抗菌药物的耐药率进行比较,MDR-Kpn对除氨苄西林、美罗培南、亚胺培南、厄他培南、阿米卡星和头孢哌酮/舒巴坦外的17种抗菌药物的耐药率均明显高于非MDR-Kpn菌株(P0.05)。2.61株菌中,只有Kpn216、Kpn225两株菌不能形成生物膜,生物膜阳性率为96.72%,其中,生物膜强阳性的14株,阳性27株,弱阳性18株,多重耐药菌与非多重耐药菌生物膜形成能力无明显差异(P0.05)。3.随机选择生物膜形成能力强的8株菌和生物膜形成能力弱的8株菌,检测生长曲线,发现细菌之间生长率的差异不明显,说明肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的不同并非由于细菌生长率的不同造成。定量检测16株菌对头孢吡肟、阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、多粘菌素B的最低抑菌浓度以及最低生物膜清除浓度,结果是Kpn形成生物膜后,对不同抗菌药物的耐药能力均有所增长,对头孢吡肟,MIC为4-64ug/ml,MBEC为320-2560ug/ml,增幅为20-640倍。对阿米卡星,MIC为1-16ug/ml,MBEC为80-5120ug/ml,增幅为40-5120倍。对环丙沙星,MIC为0.25-8ug/ml,MBEC为40-5120ug/ml,增幅为80-5120倍。对亚胺培南,MIC为0.25-16ug/ml,MBEC为160-2560ug/ml,增幅为80-5120倍。对多粘菌素B,MIC为0.5-2ug/ml,MBEC为2-512ug/ml,增幅为4-512倍。经过分析,不同菌株MIC值与MBEC值对头孢吡肟(r=0.628,p=0.01)、环丙沙星(r=0.81,p=0.0001)存在正相关性,即菌株MIC值越大,形成生物膜后的MBEC值越大。对多粘菌素B(r=0.319,p=0.229),阿米卡星(r=0.441,p=0.088)和亚胺培南(r=0.079,p=0.769)并无相关性。4.28株MDR-Kpn外排泵基因的检测中,emrB基因阳性25株,阳性率最高,为89.29%,其次是oqxA基因阳性22株,阳性率为78.57%,qacEΔ1基因阳性11株,阳性率39.29%,acrA基因阳性10株,阳性率35.71%。28株菌只Kpn215未检出外排泵基因,只携带一种外排泵基因的有4株,占14.29%,同时携带2种外排泵基因的有8株,占28.57%,同时携带3种外排泵基因的有12株,占42.86%,同时携带4种外排泵基因的有5株,占17.86%。经过统计分析,菌株携带外排泵基因种类的多少与其生物膜形成能力并无明显相关性(P0.05),4种外排泵基因阳性扩增产物经测序后与GenBank中的已提交的相应基因序列的同源性均≥98%。5.随机选取6株acrA基因阳性的肺炎克雷伯菌,对比生物膜状态与浮游状态下acrA基因的表达,发现生物膜状态下acrA基因表达存在不同程度的上调,最高上调倍数达78倍。证明生物膜的形成能够促进外排基因acrA的表达。6.当外排泵抑制剂CCCP浓度在1.25-10μg/ml时,能够不同程度促进肺炎克雷伯菌生物膜形成。结论1.多重耐药肺炎克雷伯菌检出率较高,MDR-Kpn仅对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、阿米卡星和头孢哌酮/舒巴坦的耐药率低,能够作为肺炎克雷伯菌感染的治疗用药。2.肺炎克雷伯菌生物膜阳性检出率高,多重耐药菌与非多重耐药菌生物膜形成能力无明显差异,肺炎克雷伯菌形成生物膜后的耐药能力均大幅度增加,对头孢吡肟和环丙沙星的MIC值与MBEC值存在正相关性。3.MDR-Kpn菌株外排泵基因检出率较高,大多携2种或2种以上外排泵基因,生物膜的形成能够促进外排泵基因acrA的表达。4.外排泵抑制剂CCCP低于工作浓度时能够不同程度促进肺炎克雷伯菌生物膜的形成。
【图文】：

菌株来源,肺炎克雷伯菌

株 MBEC 值判定 96 孔板置于黑色背景处，读取无浑浊培养孔的抗菌药物浓度即BEC 值。结果株标本类型和科室来源菌株标本类型株肺炎克雷伯菌临床分离菌株中，主要来自于血液 34 株，占 55.7痰 16 株，占 26.22%，分泌物 8 株，占 13.11%，尿液 3 株，，占 4.-1。

分布情况,肺炎克雷伯菌,科室,菌株

图 1-2 61 株肺炎克雷伯菌菌株科室分布情况Fig.1-2 The distribution of 61 strains of Klebsiella pneumoniae strains1.2.2 临床分离 61 株肺炎克雷伯菌的耐药谱检测结果根据 61 株肺炎克雷伯菌对 23 种抗菌药物的药敏结果，对 3 类及 3 类以上抗菌药物耐药的菌株视为多重耐药肺炎克雷伯菌(Multi-drug resistantacinetobacter klebsiella pneumoniae , MDR-Kpn),61 株肺炎克雷伯菌中，检出多重耐药菌 28 株，检出率为 45.9%（28/61），非多重耐药菌 33 株，检出率 54.1%（33/61）。临床分离的 61 株肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率最高，达 100%，对哌拉西林，头孢唑啉，头孢呋辛，复方新诺明，四环素，头孢噻肟，头孢吡肟，头孢他啶，氨曲南，头孢曲松的耐药率超过 30%，对美
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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