基于功能化纳米金的超灵敏核酸检测

发布时间：2020-03-28 23:11

【摘要】：研究背景:作为生物遗传的基石和遗传信息的载体,DNA在生命活动中发挥着重要的作用。高灵敏度的DNA检测可作为早期检测人类遗传和癌症等疾病的有效手段。上个世纪50年代DNA双螺旋的发现,开启了对DNA检测的研究。传统的DNA检测技术主要包括核酸液相杂交、扩增技术和核酸测序技术,其作为核酸检测的经典方法已经被广泛应用于实验室诊断。随着纳米技术的发展,基于纳米材料的DNA检测方法也越来越多的涌现出来。其中基于纳米金等离子的传感方法,由于操作简单,非常适用于Point-of-care Test(POCT)检测。然而,受限于现有纳米金等离子传感方法的灵敏度,其在核酸检测上尚不能满足痕量检测的需求。研究目的:本研究拟针对聚集型核酸检测灵敏度低和体系不稳定这两大问题,从解聚传感的角度出发,利用功能化纳米金形成了稳定的聚集体,引入靶标后聚集体发生解聚,即在最开始形成的聚集体即为整个体系的最大聚集,确保加入靶标后聚集体不会沉析,以达到核酸超灵敏检测的目的。研究方法:本研究基于纳米金等离子传感的原理,对纳米金进行表面功能化,利用表面修饰的聚乙二醇(poly ethylen glycol,PEG)和单链DNA(single strand DNA,ssDNA)分别在纳米金颗粒之间形成空间位阻和静电互斥,使纳米金在溶液中保持稳定。另外,特异的ssDNA序列作为识别待测核酸的生物受体,化学惰性的PEG可以促进纳米金表面ssDNA的修饰并提高ssDNA对待测核酸的杂交效率。不同于经典的待测物诱导聚集的传感策略,本课题利用纳米金耦合效应让功能化纳米金形成一定聚集但不沉析,待测核酸加入后与纳米金表面的ssDNA特异结合,增大纳米金之间距离,形成解聚效应。利用紫外可见光光谱仪对整个过程进行检测,聚集的纳米金在局域表面等离子共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)光谱上表现为肩峰的增强,加入待测核酸后,由于纳米金解聚,LSPR光谱的肩峰强度降低,肩峰强度的改变与待测核酸浓度相关。在此基础上,我们设计了两种不同的ssDNA探针:第一种为与待测核酸完全互补的ccpDNA探针作为CCP方法,待测核酸与ccpDNA结合后,阻断纳米金颗粒间的ssDNA和PEG的相互作用,使纳米金解聚;第二种为两个与待测核酸分别一半互补的hcpDNA1探针和hcpDNA2探针的等比例混合液作为MIX方法,待测核酸的加入后,分别hcpDNA1探针和hcpDNA2探针,形成三明治夹心结构,阻断纳米金表面分子间的相互作用的同时,使原本聚集的纳米金形成距离一定的纳米金集合,由于纳米金距离增加,表现出解聚的效果。研究结果:在对两种方法的核酸检测进行方法学研究,我们发现两种方法的灵敏度都很高,CCP方法的检测限为124*10~(-18)M(attoMol,aM),MIX方法的检测限为2.54*10~(-15)M(femtoMol,fM),可以满足痕量DNA的检测,不需要结合其他扩增策略。在特异性方面,MIX方法比CCP方法的特异性更高,可以识别四个碱基错配的序列。最后,我们利用双峰模拟从理论上验证了本传感方法定量检测的有效性。研究结论:本研究基于功能化纳米金的LSPR效应,利用纳米金聚集到解聚的非常规传感策略,设计了两种模式的核酸探针,对痕量核酸检测进行了探索。建立了一种快速、简单、高灵敏的核酸检测新方法,为今后应用于临床痕量核酸检测提供了实验依据。
【图文】：

20图 3-1 功能化纳米金的合成与 tDNA 检测策略（a）纳米金颗粒表面包裹低分子聚乙二醇（PEG），在表面修饰 DNA 捕获探针（ccpDNpDNA-1 或 hcpDNA-2）（b）CCP 检测方法：纳米金表面修饰 ccpDNA 探针，通过 ccpDNA 与靶 DNA (tDNA)的直合诱导纳米颗粒的解聚。（c）MIX 检测方法：纳米金表面分别修饰两种半互补的探针，hcpDNA-1 和 hcpDNA-2，例混合，通过一个 tDNA 分子与两种修饰探针的纳米颗粒的结合诱导纳米颗粒的解聚。

图 3-3 在不同情况下的 MIX 反应溶液情况（a）溶液颜色变化；（b）UV-Vis 结果1：没有 PEG 修饰的纳米金2：没有 ssDNA 探针修饰的纳米金3：未加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修饰纳米金检测体系4：加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修饰纳米金检测体系（在此研究中 tDNA 的浓度为 10-6M）在使用 hcpDNA-PEG-AuNP 混合物进行检测的情况下，与 tDNA 的杂交是的。当 tDNA 与单独的 hcpDNA1-PEG-AuNP 或 hcpDNA2-PEG-AuNP 混合tDNA 浓度下都没有发现等离子体带的改变（图 3-4c，d）。因此，当溶液NA1 或 hcpDNA2 时，溶液中存在有限的聚集，，tDNA 不与 AuNP 表面的互作用，不能引起纳米金聚集体的解聚。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R440

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本文编号：2605047