鲍曼不动杆菌耐药性与毒力相关性研究及淋病奈瑟菌头孢曲松耐药相关sRNA筛查

发布时间：2020-03-29 00:44

【摘要】：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)都属于奈瑟氏菌科细菌,均已成为严重的全球公共卫生问题。鲍曼不动杆菌常引起肺炎、菌血症、脑膜炎、伤口感染等疾病,死亡率高。淋病奈瑟菌感染引起的淋病是全球第二大性传播疾病,可导致不孕不育等严重后果。两种病原菌耐药形势日趋严峻,由于耐药问题导致治疗失败的病例不断有报道。细菌获得耐药性可能导致其毒力发生改变,鲍曼不动杆菌耐药株往往形成生物膜的能力更强,但也有相反结论的报道,其他毒力与耐药性之间的相关性未见报道。本研究第一部分旨在研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力之间的相关性,为有效防治耐药鲍曼不动杆菌引起的感染提供有效依据。细菌中存在大量非编码RNA(sRNA),sRNA参与调控细菌耐药性的作用已被广泛证明,但淋病奈瑟菌中尚未有调控耐药性sRNA的相关报道。本研究第二部分旨在发现淋病奈瑟菌中调控头孢曲松耐药性的sRNA,为解决其耐药性问题提供一个新的思路。一、鲍曼不动杆菌耐药性与毒力相关性研究为研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的相关性,对课题组收集的36株临床分离株进行16S rRNA基因鉴定,确认为鲍曼不动杆菌的菌株用纸片扩散法和微量液体稀释法检测其对9类21种抗生素的耐药性;为检测血清抗性,用10%菌液与90%正常人血清(热灭活人血清作对照)混匀后置于37 ℃培养箱中共孵育1-3 h后检测存活细菌数(CFU),当实验组CFU小于对照组CFU且存在显著统计学差异时认为该菌株血清抗性弱,无显著差异的为强血清抗性菌株;粘附试验中以感染复数(MOI)为100将菌液与人肺上皮细胞混匀后置于37 ℃培养箱中孵育1 h,用PBS洗去未粘附在细胞表面的细菌,裂解细胞后通过细菌计数检测粘附于细胞的细菌数,计算得到粘附于每个细胞的细菌数表示该菌株的粘附能力;菌株体内毒力检测时用气管插管法构建小鼠肺炎模型,选择5株耐药性不同的菌株进行感染,统计小鼠7天内死亡率。统计学分析鲍曼不动杆菌耐药性与上述3种毒力的相关性。结果显示,36株细菌中的34株为鲍曼不动杆菌,其中多重耐药株和广泛耐药株比例高达97.06%;血清抗性检测发现26株强血清抗性菌,9株弱血清抗性菌,耐药株具有更强的血清抗性;鲍曼不动杆菌耐药株粘附A549细胞的能力相对非耐药株更强;小鼠感染广泛耐药鲍曼不动杆菌7天内死亡率更高。上述结果提示鲍曼不动杆菌耐药形势非常严峻,耐药株具有更强的毒力,耐药性与毒力之间呈正相关。二、淋病奈瑟菌头孢曲松耐药相关sRNA筛查为筛选淋病奈瑟菌WHO-A株中调控头孢曲松耐药性的sRNA,首先提取WHO-A株总RNA进行转录组测序,然后通过梯度剂量诱导淋病奈瑟菌头孢曲松耐药株,生物信息学方法筛选并荧光定量PCR验证候选sRNA表达水平,反转录PCR验证耐药相关sRNA在淋病奈瑟菌临床分离株中的分布。结果显示经诱导WHO-A株产生MIC=1 μg/ml的耐药变异株,野生型WHO-A株存在1051条sRNAs,其中80条与penA、porB、mtrR等8个耐药相关基因间存在互补关系,检测发现10条表达水平随耐药性增高而降低的sRNAs,并且其中6条sRNAs在3株淋病奈瑟菌临床分离株中检测到转录产物。提示部分sRNAs参与淋病奈瑟菌头孢曲松耐药性调控,并广泛分布于淋病奈瑟菌中。
【图文】：

３．１鲍曼不动杆菌的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因鉴定逡逑１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ产物的电泳结果显示，从３６株临床分离株都能扩增出ＤＮＡ片段，逡逑长度与阳性对照鲍曼不动杆菌标准株ＡＴＣＣ１９６０６扩增产物的相同，部分结果如图１－１所逡逑示。通过ＤＮＡ测序并与ＮＣＢＩ数据库己公布鲍曼不动杆菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列进行同源比逡逑对，发现其中３４株临床分离株的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列与鲍曼不动杆菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列逡逑高度同源，确认为鲍曼不动杆菌，部分结果如图１－２所示。此外，ＡＢ６测序结果与大肠埃逡逑希菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列高度同源，ＡＢ３１测序结果与肺炎克雷伯菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列高逡逑度同源，，在后续实验中将这两株菌排除。逡逑Ｍ邋＋邋＿逦１６Ｓ邋ｒＲ＞邋Ａ基因逡逑ｉａｍｂｐ－逡逑图１－丨丨％琼脂糖凝胶电泳检测部分１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ产物逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐａｒｔ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｂｙ邋１％邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ逡逑注：Ｍ．邋ＤＬｌＯＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋＋．阳性对照（ＡＴＣＣ１９６０６邋菌液）；－．阴性对照（ｄｄＨ２０）逡逑＾逦Ｍａｘ邋Ｔｏｔａｌ邋Ｑｕｅｒｖ－邋Ｅ逦ｔ逡逑Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逦－逦ｉｄｅｎｔ邋Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ逡逑ｓｃｏｒｅ邋ｓｃｏｒｅ邋ｃｏｖｅｒ邋

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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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本文编号：2605168