辐射致抗原提呈紊乱在Treg介导的放射性肺纤维中的机制研究
发布时间：2020-04-02 11:30
【摘要】：目的:本研究基于辐射致Treg异常激活介导放射性肺纤维化的研究,探讨辐射对抗原提呈细胞的影响及其特异性激活Treg的机制,明确辐射致抗原提呈功能紊乱激活Treg介导肺上皮细胞EMT,进而参与放射性肺纤维化。本研究为放射性肺纤维化的预防诊断治疗提供新的思路和实验依据。方法:采用免疫磁珠分选技术分选小鼠原代调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)、常规性 T 淋巴细胞(conventional T cell,Tcon)和树突状细胞(dendritic cell,DC),小鼠未成熟的树突状细胞来源于体外细胞因子诱导实验。流式细胞术检测分选纯度及细胞标记物。细胞及动物照射源为60Coγ射线。体内动物实验采用铅砖局部屏蔽技术构建小鼠放射性肺纤维化模型检测Treg及DC的变化,体外实验为小鼠原代细胞共培养技术,通过TSC1特异性地siRNA及TSC1质粒构建敲低及过表达细胞模型,验证TSC1调控DC及特异性激活Treg的机制。结果:流式细胞术结果显示免疫磁珠分选小鼠原代细胞纯度为90%,分选效果良好,满足后续实验。细胞因子诱导骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)满足实验要求,在照射后CD80、CD86以及MHC-Ⅱ的阳性细胞率为60%,呈现显著地激活状态。4Gy及6Gy剂量照射DC细胞后同Tcon细胞共培养诱导Treg细胞的比例分别为15%和25%,能明显诱导Treg细胞分化。CFSE标记细胞后共培养发现照射后的DC能明显诱导Treg增殖。通过体内动物实验发现,小鼠照射后体内的DC细胞呈现显著激活状态,Treg数量在前期轻微下降后呈现显著升高的趋势。qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光实验显示DC细胞照射后TSC1的表达下降,敲低TSC1后能明显诱导Treg细胞分化,同时过表达和照射实验显示TSC1正常表达和高表达不能诱导Treg细胞分化。流式细胞术检测照射BMDC后CD80、CD86和MHC-Ⅱ显著活化,且MHC-Ⅱ在敲低TSC1相比于对照组以及过表达加照射组相比于过表达组呈现显著激活状态。ELISA实验检测照射后DC分泌细胞因子含量结果显示,IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α在照射后其含量相比于对照组均有非常显著的升高趋势,其中IL-1 β、IL-6在敲低TSC1后分泌量显著升高,过表达TSC1后分泌量变化没有统计学意义,过表达加照射组分泌量相比于对照组、照射组、过表达组的变化差异有统计学意义。流式结果发现IL-1 β在不同浓度梯度均未能诱导Treg细胞分化(阳性细胞表达率为4%)。IL-6随浓度的升高诱导Treg分化增强,与对照组相比差异有统计学意义。我们用流式细胞术检测了 MLE-12细胞Zo-1和N-cadherin的表达情况,结果发现同对照组相比实验组随着DC加入数量的增加,其诱导MLE-12细胞发生EMT的能力增强,且在DC与Tcon比值在1:1的情况下诱导EMT最为显著(阳性表达细胞率为3%),Western blot实验结果显示上皮标记物E-cadherin和Zo-1随共培养比例的增加呈现显著下调的趋势,间质标记物N-cadherin和Twist随共培养比例的增加呈现显著上升的趋势。免疫荧光实验结果发现上皮标记物E-cadherin荧光表达明显减弱,间质标记物N-cadherin荧光表达显著增强。结论:1、辐射激活DC细胞抗原提呈功能。并通过TSC1特异性的激活Treg。2、TSC1特异性调控DC中MHC-II和IL-6的表达激活Treg,并进一步促进EMT,参与RPF的发病过程。
【图文】：
部位［４］0其中上皮间充质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，邋ＥＭＴ）是放射性逡逑肺纤维化发生的最重要事件，放射性肺纤维化中成纤维细胞有三个主要途径来源，逡逑其中ＲＩＰＦ过程中成纤维细胞主要来自于ＥＭＴ过程＃３邋（如图１邋－１）。逡逑ＬＡＰ邋ＲＧＤ＇逡逑ＡＳｔｊｉｕｉｌｉｎｇ逦ｊｐ逦－ｐ逡逑Ｓｉｅｎｕｔｍｅ逦＇逡逑Ｉｍａｔｊｆｉｉｉ］，，邋ＳＵＳＳＩＳ，逡逑ＳＵ１１６Ｓ７逡逑Ｉ逡逑＇邋Ｇ＾ｉｓｅｒｔｂ邋ｓｍａ＾Ｗ逦ＥＭＴ／ＥｎｄＷＩＴ逡逑．逦逦＾＾Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：逡逑Ｉ逦Ｓｍａｄ３邋？逡逑＼逦ｉＭＩＤＣｊＵＸＴＩＭＩＭＩＸ逦／逡逑Ｆｉｂｒｏｓｉｓ逡逑Ｎｕｃｌｅｕｓ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑图１－１肺上皮细胞发生ＥＭＴ过程经典途径逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｃｌａｓｓｉｃａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｆｏｒ邋ＥＭＴ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｌ逡逑
２．１．５质粒逡逑ＴＳＣ１过表达质粒由本人亲自构建，空载质粒为ｐＣＭＶ－Ｆｌａｇ，空载质粒图谱逡逑见图２－１。逡逑（４４５７）邋Ｏｒａｎｒ逦Ｐｓｆｃｌ邋１４５ＳＳ）逡逑ｔ４３５１）邋Ｎａｅｌ逦Ｉ逦ＢｓｒＧＩ邋（３７６５逡逑＾４３４９）邋ＮｇｏＭＩＶ逦Ｓｐｅｌ邋（３３２）逡逑＾邋ｓ，，ａａｉ邋（ｓ？３３逡逑Ｊ邋＾逦ＥＣ０５３ＩＣＩ邋（３９９）逡逑（３５｛Ｈ）邋Ｘｍｒａｌ逦ｊＲ邋／邋：＜ｉ逦％邋．逦＾逦ＳＳＣＩ邋（９０１）逡逑胸：ｙS缅危苠澹澹龋椋睿洌礤澹ǎ梗樱叮唬慑义希渝澹驽澹澹掊危苠危澹牛幔浚慑澹澹危铮簦戾澹ǎ梗叮常冲义希保常罚福担卞危危苠危骸浚ǎ海俊肮﹀义希桑桑蒎危苠澹五澹苠澹祝殄澹
本文编号：2611892
【图文】：
部位［４］0其中上皮间充质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，邋ＥＭＴ）是放射性逡逑肺纤维化发生的最重要事件，放射性肺纤维化中成纤维细胞有三个主要途径来源，逡逑其中ＲＩＰＦ过程中成纤维细胞主要来自于ＥＭＴ过程＃３邋（如图１邋－１）。逡逑ＬＡＰ邋ＲＧＤ＇逡逑ＡＳｔｊｉｕｉｌｉｎｇ逦ｊｐ逦－ｐ逡逑Ｓｉｅｎｕｔｍｅ逦＇逡逑Ｉｍａｔｊｆｉｉｉ］，，邋ＳＵＳＳＩＳ，逡逑ＳＵ１１６Ｓ７逡逑Ｉ逡逑＇邋Ｇ＾ｉｓｅｒｔｂ邋ｓｍａ＾Ｗ逦ＥＭＴ／ＥｎｄＷＩＴ逡逑．逦逦＾＾Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：逡逑Ｉ逦Ｓｍａｄ３邋？逡逑＼逦ｉＭＩＤＣｊＵＸＴＩＭＩＭＩＸ逦／逡逑Ｆｉｂｒｏｓｉｓ逡逑Ｎｕｃｌｅｕｓ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑图１－１肺上皮细胞发生ＥＭＴ过程经典途径逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｃｌａｓｓｉｃａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｆｏｒ邋ＥＭＴ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｌ逡逑
２．１．５质粒逡逑ＴＳＣ１过表达质粒由本人亲自构建，空载质粒为ｐＣＭＶ－Ｆｌａｇ，空载质粒图谱逡逑见图２－１。逡逑（４４５７）邋Ｏｒａｎｒ逦Ｐｓｆｃｌ邋１４５ＳＳ）逡逑ｔ４３５１）邋Ｎａｅｌ逦Ｉ逦ＢｓｒＧＩ邋（３７６５逡逑＾４３４９）邋ＮｇｏＭＩＶ逦Ｓｐｅｌ邋（３３２）逡逑＾邋ｓ，，ａａｉ邋（ｓ？３３逡逑Ｊ邋＾逦ＥＣ０５３ＩＣＩ邋（３９９）逡逑（３５｛Ｈ）邋Ｘｍｒａｌ逦ｊＲ邋／邋：＜ｉ逦％邋．逦＾逦ＳＳＣＩ邋（９０１）逡逑胸：ｙS缅危苠澹澹龋椋睿洌礤澹ǎ梗樱叮唬慑义希渝澹驽澹澹掊危苠危澹牛幔浚慑澹澹危铮簦戾澹ǎ梗叮常冲义希保常罚福担卞危危苠危骸浚ǎ海俊肮﹀义希桑桑蒎危苠澹五澹苠澹祝殄澹
本文编号：2611892
本文链接：https://www.wllwen.com/linchuangyixuelunwen/2611892.html
最近更新
教材专著
