蛋白及核酸类生物标志物的谱学分析新方法

发布时间：2020-04-03 02:09

【摘要】：近年来,寻找和发现有价值的生物标志物(Biomarkers)以及对已知的生物标志物的高灵敏检测已经成为生物/药物分析的一个重要研究领域。生物标志物是生物体在异常或者是受到伤害的条件下产生的一类激素、核酸或蛋白质等生物物质。当器官、组织、细胞及亚细胞在受到疾病或者外部环境的损伤下,其结构和功能发生改变,产生具有生化指标的物质,发现以及高灵敏的检测这种具有特异性的生物标志物对于疾病的鉴定、早期治疗以及预防起到重要作用。谱学分析方法包括质谱法、荧光法、拉曼分析法、毛细管电泳法、电化学分析法等,它们都广泛的应用于生物标志物的检测。为了更好的分析测量生物标志物,本文选用了基质辅助激光解析/电离质谱和DNA信号放大的荧光法作为检测手段。基质辅助激光解析/电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,MALDI-MS)是一种新型的软电离生物质谱,具有高通量、高准确率及高分辨率等特点。DNA“马达”(DNA motor)也成功的应用于荧光信号的放大。基于此,本论文运用MALDI-MS和荧光构建了不同的检测方法,结合DNA“马达”自驱动信号放大的方法,实现新型生物标志物的发现以及对一系列已知生物分子的检测。具体研究内容包括以下两个方面:(1)构建一种单细胞分析的方法,通过生物质谱的检测手段研究病毒入侵细胞后细胞可能产生的生物标志物,用于呼吸道合胞病毒(RSV)的早期发现。本设计运用呼吸道合胞病毒感染HEp-2细胞,通过光学显微镜观察细胞是否被感染;随后使用简单的处理手段对细胞样品进行处理,用MALDI-MS检测细胞感染前后质谱信号峰发生的变化,通过对产生的信号峰的变化来分析研究是否有新的生物标志物产生。通过数据分析,在分子量为5000~10000 Da范围内,有3组信号峰在正常组和感染组中表达均有显著变化,其中1个差异组分在RSV感染之后表达上调(m/z=6154.25),2个差异组分在RSV感染后表达下调(m/z=7658.47和9259.82)。(2)基于以上方法,由于MALDI-MS在检测中不能很好的实现定量分析,并且MALDI-MS产生的信号峰所对应的蛋白或者是多肽比较复杂,不能对其一一解析,目前还不能用于临床上对于疾病的早期检测以及预防,因此我们运用DNA“马达”以及DNA“传送器”(DNA translator)构建一种新型、通用、具有更高准确度和灵敏度的多靶物检测方法。本设计运用DNA toehold改变的链取代反应以及以AuNP为基础构建的DNA“马达”的信号放大作用,建立了具有高灵敏度和多靶物的检测方法。当检测单靶物时,加入miRNA 10b后,DNA“传送器”会发生链取代反应,产生的单链DNA(ssDNA)启动DNA“马达”运行,从而产生荧光信号。miRNA 10b的检测在0-800 pM呈良好的检测线性,最低能检测到3.5 pM;miRNA 21的检测在0-250 pM呈良好的检测线性,最低能检测到3.5 pM。多靶物检测时,运用DNA逻辑门的原理设计出NOT-gate,OR-gate和AND-gate。例如,当使用AND-gate时,分别加入miRNA 10b、miRNA 21都不会产生ssDNA来触发DNA“马达”运行,只有同时输入两个靶物时才能发生取代反应生成ssDNA,产生荧光检测信号。综上所述,我们开发了两种不同的分析方法:基于MALDI-MS的单细胞分析方法和基于DNA“传送器”的荧光信号放大方法。前者用于鉴定RVS感染的潜在生物标志物,后者用于高灵敏的检测与乳腺癌相关的两种miRNA靶物。疾病生物标志物的鉴定和高灵敏检测对分子诊断和疾病治疗具有重要意义。
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双信号,ELISA检测

西南大学硕士学位论文物，例如利巴韦林（Ribavirin），是一种鸟苷类似物，具有抗 RSV 和病毒药物；单克隆抗体、具有高效价的多克隆免疫球蛋白制剂，能。Zhan 等[7,20]利用双信号放大等离子体酶连免疫反应（ELISA）将磁离子相结合以及 AuNP 的聚集来检测 RSV，如图 1-1 所示。Yang 等精（CD）修饰的氧化石墨烯（GO）负载姜黄素来有效抑制 RSV 对达到抗病毒活性。尽管临床对 RSV 的研究很多，但目前还没有治疗细支气管炎的方法。

纳米探针,系统检测,生物标志物

图 1-2 纳米探针通过 PRET 系统检测 miRNA21[22]。Figure 1-2 Schematic representation of the designed nanoprobe for detection of miRNA 21 based the PRET system. 生物标志物检测分析的研究现状生物标志物是机体在受到疾病或者某些外部刺激时，，机体产生的能标志疾病产生的一类物质。早在 1980 年就已经引入了“生物标志物”这个术语[39]。广义上的“
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O629.7;R44

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