异基因造血干细胞移植后肠道菌群对aGVHD的影响及预测价值

发布时间：2020-04-05 23:03

【摘要】：研究背景及目的异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治疗恶性血液疾病等的重要手段,甚至被认为是治愈某些恶性血液疾病的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后的主要并发症,也是当前制约allo-HSCT疗效的重要因素之一。多种因素影响了 GVHD的发生发展,如:HLA配型、供者来源、干细胞来源、预处理方案、供受者年龄、性别等。除此外,近年一些研究表明肠道菌群与急性GVHD(acuteGVHD,aGVHD)的发生发展密切相关。肠道菌群与机体免疫稳态密切相关,肠道菌群紊乱会改变上皮和粘膜通透性,打破免疫稳态,导致炎症性疾病的发生。在allo-HSCT动物模型显示:肠道厌氧菌(如梭状芽孢杆菌等)的代谢产物短链脂肪酸,可促进CD4+T细胞内乙酰化组蛋白的表达,进一步促进Foxp3的组蛋白乙酰化,介导调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的组蛋白修饰作用,诱导免疫耐受,减轻aGVHD。此外,需氧菌(如致病性肠杆菌等)除了产生肠毒素破坏肠粘膜并抑制厌氧菌生长外,还可产生大量脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),LPS透过损伤的黏膜屏障进入血液循环并到达全身靶器官,激活T细胞,导致Th细胞分化失平衡,促进aGVHD发生。但是在人体内,肠道菌群影响T细胞免疫平衡的机制还不清楚。尤其是aGVHD发生前,肠道菌群对机体细胞免疫,Th细胞分化平衡等的影响,以及哪些菌群在aGVHD的发生发展中起关键作用都亟待进一步研究。基于以上科学问题,本研究目的是:探讨allo-HSCT后aGVHD和未发生aGVHD患者,在移植前和造血植入时肠道菌群、T细胞亚群的差异性;分析肠道菌群与机体免疫之间的关系;揭示肠道菌群在aGVHD的发生发展中作用及机理;为临床aGVHD预测及aGVHD防治提供新的思路和依据。方法(1)临床样本收集:2015年1月至2016年12月在我院接受allo-HSCT的受者,分别收集病人预处理前、造血植入时(造血植入后第3-4天)粪便1g左右及外周血4-5ml。基于移植后100内aGVHD发生情况分为二组:aGVHD组(Ⅱ-Ⅳ aGVHD);non-aGVHD组(0-1 aGVHD)。(2)肠道菌群检测:利用HiPure Stool DNA Kit试剂盒提取菌群基因组DNA,用荧光定量方法检测样品浓度,使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定样品完整性。对提取的基因组DNA进行PCR扩增,构建菌群文库,使用Agilent 2100 Bioanalyzer对菌群文库质控;利用HiSeq 2500测序仪对PCR扩增产物的16s rRNA V3-V4可变区进行测序,通过SILVA数据库将所测序列进行序列比对,并经多样性指数、LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe)分析等方法对各组微生物种类进行多样性和分类学的比较,以期发现aGVHD患者肠道菌群的差异性改变。(3)T细胞亚群的检测:采用流式细胞术检测外周血T细胞亚群(Treg、Th17、Th1)的比例,CD4+T细胞内乙酰化组蛋白H3(ace-H3)和ace-H4表达水平(中位荧光强度(median fluorescence intensity,MFI))。(4)细胞因子的检测:采用液相芯片技术检测血浆细胞因子----白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A及干扰素(interferon,IFN)-γ表达水平。(5)相关性分析:采用Spearman相关分析,分析肠道菌群与T细胞亚群、CD4+T细胞内乙酰化组蛋白水平的相关关系。(6)对aGVHD的预测:基于移植后患者肠道菌群特征,通过ROC(receiver operator characteristic,ROC)曲线下面积(AUC)评估菌群对aGVHD的预测价值。对AUC≥0.65的菌群,通过菌群累计积分再对aGVHD预测,并分析菌群积分与aGVHD分级的相关性。结果(1)二组病人临床与移植特征:在81例纳入本研究的患者中,移植后32例患者发生Ⅱ-IV度aGVHD、49例患者发生I度aGVHD或没有发生aGVHD。两组病人除了 aGVHD组有更多病人接受强化预处理,临床特征无明显差异。(2)二组抗菌药物应用:在造血植入前,aGVHD组较non-aGVHD组有更多病人接受β-内酰胺类抗菌药(预处理开始至植入前,连用3天或以上)。(3)预处理前二组菌群:预处理前二组病人的菌群多样性无显著差异。菌群结构方面,在门、纲、目、科、属水平均没有显著差异。(4)造血植入时二组菌群差异:造血植入时aGVHD组菌群多样性低于non-aGVHD组。在菌群结构方面,从纲水平看,梭菌纲(Clostridia)的丰度在aGVHD 组少于 non-aGVHD 组,而 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)在 aGVHD组多于 non-aGVHD 组。在科水平,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 等的丰度在 aGVHD 组少于 non-aGVHD 组,而 Enterobacteriaceae 在 aGVHD 组多于non-aGVHD 组。(5)抗菌药物及预处理对肠道菌群的影响:β-内酰胺类抗菌药物和万古霉素均导致菌群多样性降低。同时β-内酰胺类药物会导致Lachnospiraceae丰度降低;万古霉素则导致Enterobacteriaceae丰度升高。其次,强化预处理较标准预处理会导致菌群多样性降低,以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceaee丰度降低。没有发现其他因素对菌群的显著影响。(6)aGVHD的危险因素:Cox回归模型分析显示,β-内酰胺类抗菌药物应用和移植后低菌群多样性是aGVHD的独立危险因素。而患者年龄、供者类型、万古霉素(静脉)等不是aGVHD的独立危险因素。(7)植入时二组T细胞亚群及细胞因子水平:造血植入时aGVHD组外周血Treg细胞占CD4+细胞比例低于non-aGVHD组。而aGVHD组Th17细胞比例高于non-aGVHD组。Th1细胞比例没有显著差异。血浆中细胞因子IL-17A水平在aGVHD组高于non-aGVHD组,而IL-4、IL-10、IFN-γ表达水平没有显著差异。(8)CD4+ T细胞内乙酰化组蛋白水平与T细胞亚群的关系:aGVHD组CD4+T细胞内ace-H3的MFI水平低于non-aGVHD组。ace-H4的MFI水平二组没有显著差异。ace-H3的MFI水平与Treg/Th17细胞数比值正相关。没有发现ace-H4与Treg/Th17有相关性。(9)肠道菌群与免疫的关系:Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 和Enterobacteriaceae的丰度与Treg/Th17细胞数比值分别呈正相关、正相关和负相关。Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 的丰度与 CD4+T 细胞内 ace-H3 的 MFI水平呈正相关。(10)肠道菌群对aGVHD的预测价值:在探索肠道菌群对aGVHD的预测价值时发现,四种菌科的丰度----Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Enterobacteriaceae 和 Peptostreptococcaceae 能预测 aGVHD 的发生。这四种菌群累计积分后预测Ⅱ-Ⅳ和Ⅲ-ⅣaGVHD的ROC曲线下面积分别为0.73和0.85。而且,四种菌群的积分与aGVHD的分级密切相关(r = 0.560,P0.001)。结论(1)在allo-HSCT后造血植入时,肠道菌群多样性和菌群结构都与aGVHD的发生密切相关,而特定菌群的变化与抗菌药物应用和预处理损伤有关。(2)allo-HSCT后,肠道菌群与外周Treg/Th17细胞免疫平衡以及CD4+T细胞内的ace-H3水平密切相关,可能影响Treg/Th17的免疫平衡及aGVHD发生发展。(3)allo-HSCT后造血植入时肠道菌群组合积分不仅能够预测aGVHD的发生,而且能够预测aGVHD严重程度。
【图文】：

细胞,辅助细胞,同种异体,细胞毒性

ＨＬＡ）的不同，激活同种异体供者Ｔ细胞介导的细胞毒性反应，发生Ｔ细胞亚逡逑群的免疫失衡和细胞因子级联反应进而引起对受者组织器官的损伤［２，３］。逡逑从ａＧＶＨＤ的病理生理过程来看，ａＧＶＨＤ主要分为三个阶段（图１）邋［４，５］，逡逑首先，在预处理过程中，，大剂量或超大剂量化疗和放疗导致宿主组织损伤，继逡逑而引起炎症因子如ＴＮＦｋｘ和ＩＬ－ｌｐ邋（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｉｐ，ＩＬ－ｉｐ），趋化因子和细菌产逡逑物（如：脂多糖等）的释放以及病原体相关分子模式（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ逡逑ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ，邋ＰＡＭＰｓ）表达，导致宿主固有免疫细胞活化，包括抗原呈递逡逑细胞（Ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ邋ｃｅｌｌｓ，邋ＡＰＣ）；其次，活化的抗原呈递细胞例如树突细逡逑胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ｃｅｌｌ，ＤＣ）迁移到淋巴结，激活同种异体反应性供体Ｔ细胞，供逡逑者的ＣＤ４＋Ｔ细胞活化并分化成包括Ｔ辅助细胞１邋（Ｔｈｌ邋），和Ｔ辅助细胞１７邋（Ｔ逡逑辅助１７，Ｔｈｌ７），供体ＣＤ８＋Ｔ细胞分化为细胞毒性Ｔ细胞１邋（Ｔｅｌ）和细胞毒逡逑性Ｔ细胞１７邋（Ｔｃｌ７）。最后

流程图,流程图,全相,来源

逑１．２方法逡逑１．２．１实验技术路线（图１－１）逡逑／邋／逡逑Ｌ逦７逦’逡逑／逦ＤＮＡ提取逦ｍ逦—？？？逡逑Ｉ逦，…逦／逡逑ｉ逡逑｜逦ＤＮＡ检n,逡逑）Ｙｅｓ逡逑￣接头连接逡逑＇邋ｒ逡逑文库构建逡逑ｚＺ’＇、．邋Ｎｏ逡逑、丫＜邋ｉ逦逡逑Ｃｌｕｓｔｅｒ制备与测序－＊｜统计分析￣｜逡逑图１－１邋｜粪便检测及测序分析流程图。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋｜邋Ｐｒｏｔｏｃｏｌ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋Ｇｅｎｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｆｏｒ邋Ｆｅｃａｌ邋Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ逡逑１．２．２标本采集逡逑研宄对象为２０１５年１月－２０１６年１２月在我院接受ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ的受者，入组逡逑年龄１８－６０岁。患者在治疗前须完成血常规、肝肾功能、心电图、肺部ＣＴ、肺逡逑功能等检查，并排除移植禁忌。收集患者移植（预处理）前、造血植入时（造逡逑血植入后第３－４天）粪便ｌｇ左右。基于移植后１００内ａＧＶＨＤ发生情况分为二逡逑组：ａＧＶＨＤ邋组（ＩＩ－ＩＶａＧＶＨＤ）；邋ｎｏｎ－ａＧＶＨＤ邋组（０－ＩａＧＶＨＤ）。逡逑１．２．３邋ＨＬＡ配型和供者来源逡逑供受者配型均为高分辨基因配型，包括ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＱＢ１、－ＤＲＢ１，共逡逑１０个位点。供者来源：ＨＬＡ配型全相合供者为ＨＬＡ相合位点＞８，包括同胞逡逑全相合供者以及无关供者；ＨＬＡ配型不全相合供者为ＨＬＡ相合位点￡８，为单逡逑倍型供者。逡逑１１逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R457.7

【参考文献】