基于toehold介导链置换反应和滚环扩增技术的核酸生物传感检测方法研究

发布时间：2020-04-15 23:58

【摘要】：目的:核酸检测对于疾病的诊断、疗效评估、动态监测至关重要。Toehold exchange和toehold displacement是广泛应用于核酸生物传感方法中保证核酸检测特异性的两种链置换反应策略。然而,目前仍缺少对这两种策略的直接比较以确定哪一种策略更适合临床核酸检测。滚环扩增(RCA)是一种高效的核酸等温扩增技术,其具有操作简单、灵敏、快速等特点而在核酸分析中倍受青睐。在本研究中,我们将系统性地比较toehold exchange和toehold displacement两种链置换反应,以获得保证核酸检测高特异性的策略,并尝试提高链置换反应效率;探索耦合链置换反应与RCA技术用于保证核酸检测的特异性和灵敏度,建立一种更具通用性的RNA检测新方法。方法:首先,我们分别在三种不同缓冲溶液(20 mM Tris-HCL(含1M Na~+)、1×PBS(pH 7.4,10 mM PBS)、1×TAE)中系统性地比较了toehold exchange和toehold displacement的检测特异性,并计算其实验区分因子和理论区分因子。然后,我们提出并证实了"拉动策略",即在toehold exchange反应达平衡时,加入新的探针与toehold exchange产物反应,打破原反应平衡,以提高toehold exchange正向反应效率从而提高检测信号。最后,我们以miRNA let-7d为检测模型,基于溶解转换的发夹探针耦合toehold exchange和RCA建立了用于RNA检测的特异性识别和通用性信号放大的荧光传感方法。结果:1.Toehold exchange相对于toehold displacement显示出更高的特异性,其中toehold exchange的实验DF值为6左右,toehold displacement的实验DF值为1左右;2."拉动策略",即在toehold exchange反应达平衡加入新的探针消耗toehold exchange产物,提高链置换正向反应效率,将检测信号提高了2-3倍,而检测特异性几乎不变。3.以miRNA let-7d为检测模型,所建立的RNA检测方法的线性范围为1 fM-1 nM,检测下限为0.46 fM,并能区分2 nt或3 nt差异的同家族miRNA。结论:1.Toehold exchange相对于toehold displacement在实验和理论上均具有更高的平衡特异性,该结论将为后续建立核酸特异性检测方法提供参考与指导。2."拉动策略"将为提高核酸检测灵敏度提高新的契机,且几乎不影响核酸特异性。3.基于溶解转换的发夹探针耦合toehold exchange和RCA建立了用于RNA检测的荧光传感方法,该方法显示出良好的检测性能,并且仅需改变检测探针序列而不需重新设计RCA模板序列便可用于对其他RNA的检测,更具通用性。
【图文】：

检测性能

14图 1.1 Toehold displacement 和 toeholdexchange 检测性能的比较Figure 1.1 Performance comparision of toehold exchange and toehold displacement

反应速率,猝灭效应,荧光基团,吉布斯自由能

体系荧光信号急剧下降，，这是因为稀释效应和链置换所导致的猝灭效应的叠加（图 1.2C，右边）。基于图1.2C，我们计算出 ΔGsep约为 0.995 kcal mol-1。因此，荧光基团和猝灭基团标记核酸链后会增加杂交反应的吉布斯自由能，降低了链置换反应的效率。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R440;TP212.3

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