拉曼光谱技术快速筛查耐粘杆菌素大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的研究

发布时间：2020-04-20 01:28

【摘要】：研究背景抗生素在畜牧业和医疗卫生行业中的滥用极大促进了细菌的耐药。近年来,多重耐药革兰氏阴性细菌(Multidrug-resistant Gram-negative Bacteria MDRGNB)不断涌现,使得粘杆菌素成为抵御其感染的唯一有效药物。粘杆菌素(多粘菌素E)发现于19世纪40年代,可有效治疗多种革兰阴性菌的感染。但由于较大的肾毒性和神经系统毒性一度被弃用,因此当前粘杆菌素耐药现象较为罕见。传统的观点认为粘杆菌素耐药仅仅通过细菌染色体介导而在各菌株垂直传递。但是,2015年我国学者在国际上首次报道了大肠杆菌质粒mcr-1基因介导的粘杆菌素耐药。预示存在着粘杆菌素耐药在同一种属细菌的不同菌株或者不同种属细菌间相互传播扩散的潜在威胁。这将导致出现MDRGNB感染后无有效药物可用的紧迫局面。及时准确发现耐药菌株并加以控制“隔离”是防止粘杆菌素耐药扩散的关键。另一方面,MDRGNB如鲍曼不动杆菌或铜绿假单胞菌的感染往往危及病人生命,快速准确分析其粘杆菌素敏感性可有效协助治疗,挽救患者生命。因此,行之有效的粘杆菌素耐药快速检测方法是应对可能出现的“无药可救”的MDRGNB感染紧迫局面的重要手段。美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI)和欧盟药敏试验委员会(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST)所推荐的粘杆菌素药敏试验标准方法为微量肉汤稀释法(Broth Microdilution Method BMD)。但该方法费时费力,细菌需经过纯化培养后再培养16-24小时才能获取药敏试验结果。纸片扩散法和E-test法同样需要16-24小时,且其检测原理都基于药物在琼脂糖中的扩散。由于粘杆菌素分子在琼脂糖中扩散速率低,导致药敏结果出现较高的假阴性率。而在所有的全自动药敏分析仪中,法国梅里埃Vitek 2系统可在较短的时间内完成检测,约4-10小时。但其检测灵敏度仅42%。因此,当前亟需开发粘杆菌素耐药菌快速检测新方法!拉曼光谱技术是有力、可靠的细菌检测及表征技术。起源于分子基团振动的拉曼图谱被视为生物分子结构及组成的“指纹谱”。同时作为分子振动光谱,拉曼光谱能在分子层面提供细菌与抗菌药物相互作用的有效信息。这将有利于拉曼光谱在细菌药敏试验研究中的运用。综上,本研究提出利用拉曼光谱技术建立快速筛查耐粘杆菌素大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的新方法。目的:(1)分析引起细菌粘杆菌素暴露组与非暴露组间拉曼光谱差异的原因,为拟建立的粘杆菌素耐药分析新方法提供理论支撑。(2)探索在检测试样表面不同区域、不同厚度层面采样的拉曼光谱的差异程度,说明拟建立的耐药分析方法的检测重复性。(3)分别确立大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的粘杆菌素药物暴露组药物浓度,并使用于耐药菌筛查。(4)初步建立大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌粘杆菌素耐药菌株快速筛查新方法。方法(1)利用主成分分析方法分析暴露组与非暴露组之间拉曼光谱的差异;获取0.3McF的CAMHB与0 McF、0.2 McF、0.4 McF、0.8 McF细菌菌液混合试样的拉曼光谱,以说明拉曼光谱信号的物质来源;测定细菌培养液中蛋白质、核酸浓度及细菌数量以说明引起暴露组与非暴露组光谱差异的物质基础;获取相同数量的暴露组细菌与非暴露组细菌拉曼光谱,以说明流失的蛋白质和核酸等物质对试样拉曼光谱变化的贡献。(2)利用共聚焦拉曼光谱技术可在试样进行纵向高分辨率采样的技术优势,获取试样10μm、20μm、30μm、40μm厚度处的拉曼光谱;以及距离样本中心分别为100μm、200μm、300μm、400μm处的拉曼光谱,以核酸拉曼特征峰746 cm~(-1)与淀粉拉曼特征峰481 cm~(-1)处的拉曼强度比值的常用对数值(log R)为比较参数,对比各光谱间的差异程度,以说明拟建立方法的检测重复性。(3)分别测定三种细菌粘杆菌素最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration MIC)为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的菌株的药物最低暴露浓度;根据CLSI和EUCAST的关于三种细菌的粘杆菌素耐药cut-off值确立暴露组粘杆菌素用药浓度。(4)检测三种细菌共123株临床菌株,其中大肠杆菌42株,敏感菌30株,耐药菌12株;鲍曼不动杆菌41株,敏感菌30株,耐药菌11株;铜绿假单胞菌40株,敏感菌30株,耐药菌10株,初步评价拟建立方法的检测灵敏度和特异度。结果(1)暴露组和非暴露组拉曼光谱存在明显差异,经过第一主成分(1st Principle Component PC1)的载荷图结果分析,暴露组细菌中蛋白质及核酸含量显著低于非暴露组,但淀粉类物质含量高于非暴露组;不同比例的CAMHB与菌液混合后拉曼光谱变化明显,菌液比例越高则归属于蛋白质和核酸的拉曼谱带信号强度越高,而CAMHB比例升高则淀粉类物质的拉曼峰强越强;暴露组培养液中核酸和蛋白质浓度显著高于非暴露组,细菌数量则显著低于暴露组;相同数量的暴露组细菌与非暴露组细菌拉曼光谱差异明显,说明流失的生命物质对拉曼光谱产生了较大影响,所引起的光谱差异可以被检测出。(2)检测试样不同区域拉曼光谱所计算得出的log R均值为0.200±0.0419,不同厚度层的拉曼光谱所计算得出的log R均值为0.187±0.037,log R值波动范围较小,说明在试样表面随机采样时光谱差异程度较低。(3)每种细菌中粘杆菌素药敏程度不同的菌株,其最低粘杆菌素暴露浓度随其粘杆菌素最低抑菌浓度的增大而升高;粘杆菌素药敏程度相同的三种细菌中,鲍曼不动杆菌的最低暴露浓度最高;最终确立了本方法暴露组的粘杆菌素用药浓度为:大肠杆菌,1μg/ml;铜绿假单胞菌,1μg/ml;鲍曼不动杆菌,3μg/ml。(4)方法学评价结果:三种细菌总体检测灵敏度为90.9%,特异度为91.1%;其中大肠杆菌检测灵敏度为91.7%,特异度为93.3%;鲍曼不动杆菌检测灵敏度为90.9%,特异度为86.7%;铜绿假单胞菌检测灵敏度为90.0%,特异度为93.3%。结论(1)本粘杆菌素耐药性分析方法所制备的检测试样是细菌菌体与CAMHB沉淀物的混合物样本。试样拉曼光谱来自两部分,一部分为细菌菌体蛋白质、核酸等生命物质,另一部分则来自CAMHB培养基的沉淀物(主要为淀粉);药物暴露组细菌由于胞内物质大量流失和细菌数量减少,导致混合物试样中菌体部分比例降低,因此试样拉曼光谱中与生命物质相关的蛋白质、核酸等的拉曼峰峰强下降。通过聚类分析可以实现暴露组和非暴露组拉曼光谱的分类。(2)混合物试样的不同区域或不同厚度层拉曼光谱的log R值说明该混合物具有很高的均质性,因此可以保证拉曼信号采集的稳定性,随机采样不会影响检测结果,即保证了粘杆菌素耐药菌株检测的高检测重复性。(3)在粘杆菌素最低抑菌浓度相同的三种细菌中,大肠杆菌与铜绿假单胞菌的粘杆菌素最低暴露浓度较接近而鲍曼不动杆菌最高,这可能与细菌表面的携带电荷数,细菌的菌体体积大小、形状相关,需进一步的研究论证。(4)通过123株临床菌株的检测验证,检测效果最好的是大肠杆菌,较为不佳的是鲍曼不动杆菌。然而90.9%的总体检测灵敏度和91.1%的检测特异度再加上1.5小时的高效检测速度说明了新建立的粘杆菌素耐药分析方法的优越性。有望实现对革兰阴性细菌粘杆菌素耐药菌株的快速、高效筛查,成为防控粘杆菌素耐药扩散的重要方法。
【图文】：

粘杆菌素,抗生素,全球策略,药品监督管理局

抗生素在全球范围内畜牧业和医疗卫生行业中的滥用使抗生素恶化。据预测，到 2050 年全球抗菌素耐药每年将导致 1000 万人死亡济损失 100 万亿美元（图 1）[1]。有鉴于此，世界卫生组织（World on WHO）早在 2001 年就提出遏制抗生素耐药的全球策略[2]，并呼吁使用抗生素以预防抗生素耐药性蔓延。然而，，近年来同时耐受氨基糖、β-内酰胺类以及碳青霉烯类（非典型 β-内酰胺类）抗生素的 MDRG再加上新型抗菌药物的研发进展迟缓，使得古老的抗生素粘杆菌素类DRGN 细菌感染的唯一有效药物。菌素发现于 1947 年，是从土壤细菌多粘类芽孢杆菌中分离出的一种阳tionic Anti-microbial Peptide CAMP）[3]。可有效治疗多种革兰阴性杆细菌，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等引起的感染。粘杆菌素首先在推广使用，随后于 1959 年美国食品药品监督管理局批准了粘杆菌素在应用[3]。

分子结构图,粘杆菌素,分子结构

上世纪 70 年代，由于具有较严重的肾毒性和神经系统毒性作用更低的抗生素如氨基糖甙类、喹诺酮类和 β-内酰胺类此仅限于各种皮肤病的外用治疗和由铜绿假单胞菌感染引疗。这可能是目前粘杆菌素耐药现象仍然少有报道的主要分子包含携带阳离子的环状七肽和与之相连接的脂肪酸链阴性细菌感染治疗的主要机制有以下两方面：一方面，带性细菌外膜中携带负电荷的类脂 A 分子具有高度亲和力。，环状七肽取代类脂 A 分子磷酸基团的 Ca2+或 Mg2+，因。随后其脂肪酸链插入细菌胞浆质膜的磷脂分子层之间，内生命物质不断流失，最终导致细菌死亡[5]。另一方面，内毒素（脂多糖 LPS）的主要毒性因子，血液中的粘杆菌中和释放入血的内毒素，从而起到缓解内毒素血症的作用
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5

【相似文献】