NO诱导的富含miR-126的胎盘间充质干细胞外泌体治疗大鼠脓毒症

发布时间：2020-04-22 22:58

【摘要】：背景脓毒症每年全球发病人数约有2700-3000万人,死亡人数仍高达700-900万。脓毒症目前仍缺乏有效的治疗手段。近年来,随着干细胞研究的深入,干细胞治疗脓毒症取得了良好的效果,但其作用机制并不是通过其分化增殖来替代坏死细胞;而是依靠其旁分泌功能,通过免疫调节纠正机体失衡的免疫功能,从而发挥治疗作用。另外,干细胞治疗存在致癌风险、错过最佳治疗窗口、到达患处细胞数量少等缺点。再生实验研究表明,外泌体是干细胞发挥其旁分泌功能的重要物质载体。外泌体利用其内容物使得靶细胞重编程,进而发挥其调控作用。其中mi RNA是外泌体主要药效分子之一。近来有研究表明,NO诱导的富含mi R-126的胎盘间充质干细胞外泌体具有促进损伤血管再生修复的作用,而血管内皮损伤和DIC是脓毒症重要病理机制。因此,提出假设:NO诱导的富含mi R-126的胎盘间充质干细胞外泌体具有治疗脓毒症的作用。本实验试图通过构建脓毒症大鼠模型,验证外泌体的治疗作用,同时探索其可能的药理机制。研究目的1、第一部分:首先对胎盘间充质干细胞分离培养,对其进行NO诱导,进而从条件培养基中富集三种不同外泌体,进行鉴定、比较,为后续实验提供材料。2、第二部分:建立大鼠脓毒症模型,研究富含mi R-126的外泌体对脓毒症大鼠的治疗效果,并探索其可能的药理机制。实验方法1、第一部分:临床获取健康的胎盘,选择酶消化法进行人胎盘间充质干细胞(hp-MSC)的培养和传代;取第4代hp-MSC,利用NO、mi R-126抑制剂及无效对照抑制对其进行诱导培养,通过超速离心法获取3种外泌体(N-Exo、I-Exo和Exo);利用透射电镜观察对比外泌体形态,利用Western Blot法检测外泌体表面标志分子;利用q RT-PCR检测和对比三种外泌体mi R-126-3p和-5p的含量,从而全面鉴定外泌体,并比较三者间的差异。2、第二部分:建立脓毒症大鼠模型,并分为四组:对照组(C组,假手术+PBS)、脓毒症组(S组,CLP+PBS)、Exo治疗组(N组,CLP+N-Exo)、I-Exo治疗组(I组,CLP+I-Exo)。建模后48h,检测各组大鼠血肝肾功能指标(ALT、AST、BUN)、炎症因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-1β);取肺、肾HE染色,并做病理评分;测量肺和肾血管微渗漏及干/湿重之比;利用q PCR检测各组大鼠肾脏mi R-126-3p及-5p含量,利用western blot检测肾脏内HMGB1、RAGE、TRL-2、TRL-4、p-p65蛋白含量。最终,观察并统计四组大鼠的7天存活率。结果1、第一部分:三种外泌体均为圆形膜囊泡,形态上无显著差异;N-Exo的平均粒径大小为70.9±5.3nm;Exo为71.5±4.4nm,I-Exo为72.3±5.1nm,三种外泌体粒径比较无显著统计学差异(P0.05);三种外泌体均高表达CD9和CD63,几乎不表达Tubulin;三种外泌体中mi R-126的含量具有显著的统计学差异(P0.05),I-ExoExoN-Exo。2、第二部分:(1)各组大鼠的七天存活率:S组和I组间无显著的统计学差异(P0.05),但均显著低于N组和C组(P0.05);(2)术后48h,肝肾功能及炎症因子含量、肺和肾病理评分、血管微渗漏及干/湿重之比:S组和I组、N组和C组间无显著的统计学差异(P0.05),但S组和I组显著高于N组和C组(P0.05);(3)各组肾脏内mi R-126-3p和-5p的含量:S组和I组、N组和C组间无显著的统计学差异(P0.05),但S组和I组显著低于N组和C组(P0.05);(4)各组肾脏内HMGB1、RAGE、TRL-2、TRL-4、p-p65蛋白含量:S组和I组、N组和C组间无显著的统计学差异(P0.05),但S组和I组显著高于N组和C组(P0.05)。结论1、本研究成功培养诱导了三种不同的胎盘间充质干细胞外泌体,同时对其进行了鉴定对比,NO能明显提高干细胞外泌体中mi R-126含量。2、N-Exo可能是通过mi R-126的输注,降低了脓毒症大鼠HMGB1的水平,进而通过受体信号的转导,抑制NF-κB激活,进而抑制多种炎症因子的释放,并缓解炎症反应,保护重要器官的功能,最终提高脓毒症大鼠的存活率。
【图文】：

图 1 外泌体透射电镜照片显示，3 种外泌体均为直径约为 70nm 的圆形如图 1）径分布图 2 三种外泌体粒径分布图仪，，分别测得三种外泌体（Exo、N-Exo、I-Exo 的平均粒径大小为 70.9±5.3nm；Exo 的平的平均粒径大小为 72.3±5.1nm，三者间无

25图 2 三种外泌体粒径分布图利用激光散射仪，分别测得三种外泌体（Exo、N-Exo、I-Exo）的粒径分布图，如图 2 所示。N-Exo 的平均粒径大小为 70.9±5.3nm；Exo 的平均粒径大小为 71.5±4.4nm，I-Exo 的平均粒径大小为 72.3±5.1nm，三者间无显著的统计学差异（P>0.05），三种外泌体绝大部分粒径均介于 55-85nm 之间。3.1.3 外泌体的表面标志物
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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本文编号：2637063