基于分子信标杂交技术快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立与应用

发布时间：2020-05-01 13:21

【摘要】：目的:建立直接鉴定阳性血培养或固体培养基分离阳性标本中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的分子信标(Molecular Beacon,MB)荧光原位杂交方法,通过荧光显微镜或流式细胞仪对荧光信号进行识别,从而实现对SA的快速检测,并评估该方法的临床应用。方法:针对SA的16S rRNA基因序列,合成三条特异性分子信标探针(MB1、MB2和MB3),其中MB1和MB2为本研究设计,MB3为文献报道的SA探针,对三条探针的信噪比(S/N值)和热变性曲线等进行评估,筛选出最佳探针。对杂交体系的优化包括分子信标浓度(0μmol/L~2μmol/L)、MgCl_2浓度(0mmol/L~7mmol/L)以及去离子甲酰胺浓度(0%~55%)等。设计多条与筛选出的分子信标不匹配基因序列,通过热变性曲线和荧光导数曲线筛选最佳杂交温度。优化溶葡萄球菌素透化处理SA细胞壁的浓度(0U/mL~20U/mL)。采用该杂交体系检测阳性血培养或固体培养基分离的10种临床常见菌株及标准菌株(革兰氏阳性球菌),通过荧光显微镜识别荧光信号,评价该杂交体系对SA检测的特异性。利用SA标准菌株,采用流式细胞仪检测阴性空白SA菌液及分子信标SA菌液,统计两组平均荧光强度差异。以阴性空白SA菌液、分子信标杂交SA菌液及非特异性荧光染料PI染色SA菌液为对照,通过流式细胞仪检测200份血培养标本待测阳性球菌,与传统的表型鉴定方法比较,评价该杂交体系检测SA的特异性和灵敏度。结果:设计、合成的MB1的S/N值均高于MB2和MB3的S/N值(均P0.001)。不同浓度下MB1S/N值均大于20,MB1的热变性曲线结果显示在温度低于50℃荧光强度保持稳定(接近本底荧光),在50℃~65℃荧光强度逐渐增强,大于65℃荧光强度逐渐减弱。建立的MB1杂交体系为:1.4μmol/L MB1、2.5 mmol/L MgCl_2、25%去离子甲酰胺。当温度低于45℃时MB1可区分两个碱基不匹配基因序列,当温度在45~50℃可区分单碱基不匹配基因序列,温度高于50℃影响MB1稳定性。SA细胞壁最佳透化条件为:7.5 U/ml溶葡萄球菌素作用5 min;优化后的杂交体系与阳性血培养或固体培养基分离的临床菌株及标准菌株杂交,在荧光显微镜下仅有SA产生荧光信号,其余均未见荧光。流式细胞仪检测分子信标杂交SA菌液平均荧光强度(11.47±2.27)高于阴性SA菌液的平均荧光强度(1.71±0.59),P0.001。该方法检测200份血培养标本中待测阳性球菌,对SA检测的特异性和灵敏度分别为100%和95.83%,与传统的表型鉴定方法相比具有极强的一致性(Kappa值=0.967)。结论:(1)基于分子信标荧光原位杂交方法可通过荧光显微镜或流式细胞仪实现血培养阳性或固体培养基分离的SA快速鉴定。(2)基于分子信标荧光原位杂交方法应用于血培养阳性标本中SA的检测,特异性和灵敏度高,与传统的表型鉴定方法比较具有极强的一致性。
【图文】：

工作原理,分子信标探针,感染性疾病,培养技术

图 1 分子信标工作原理总之，SA 是人类感染性疾病的重要致病菌之一，快速、及时的检测病原菌是控制SA 感染和改善患者预后的重要环节。但是，无论是传统基于培养技术的表型鉴定方法，还是不断开发的新技术，，均不是理想的 SA 鉴定方法。本课题针对 SA 的 16S rRNA 基因序列，设计、合成特异性分子信标探针，构建基于分子信标荧光原位杂交体系直接鉴定阳性血培养或固体培养基分离阳性标本，通过荧光显微镜或流式细胞仪对荧光信号进行识别，从而实现对 SA 的快速检测，并评估该方法的临床应用。

流程图,临床实验室,表型,流程图

主；（4）用接种环在固体培养基上取单个菌落，将其置于洁净的玻片上，然后滴加 1滴触酶试验试剂并立即观察结果。菌落与触酶试剂反应产生大量气泡者为阳性，反之为阴性。SA 触酶试验为阳性；（5）对触酶试验阳性的菌落进行血浆凝固酶试验，取兔血浆及盐水各 1 滴，分别置于洁净玻片上。然后用接种环取疑似菌落并分别与盐水及血浆混合。10 秒内观察结果，如血浆中有明显颗粒出现，而盐水中无自凝现象者为阳性。SA 血浆凝固酶试验为阳性。（6）鉴定：从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取单个纯菌落，按照 VITEK-Compact全自动细菌鉴定药物敏感分析系统操作要求对菌落进行鉴定。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5

【参考文献】