肠道病毒71型RT-RPA检测方法的建立与评价

发布时间：2020-05-05 13:53

【摘要】：背景和目的手足口病是亚太地区重大的公共卫生问题之一,主要发生在年龄≤5岁的儿童,主要的病原体是柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)。EV71是一种高传染性病毒和嗜神经肠道病毒,已多次在亚太地区引发了手足口病的暴发和流行,是重症手足口病和死亡病例的主要病原体。自从EV71在中国首次报道后,EV71引起的手足口病疫情在中国呈不断上升趋势,给中国带来了极大的经济和疾病负担,是中国面临的重大公共卫生问题之一。1998年之后,EV71 C4基因亚型(EV71 subgenotype C4,EV71-C4)几乎成为唯一一种在中国大陆流行的EV71基因亚型。目前仍无有效针对EV71的抗病毒药物,早发现、早诊断和早治疗有助于及时防止EV71疫情扩散,延缓病情的进展。因此,建立一种早期、快速、准确的EV71-C4检测方法对于中国大陆预防重症手足口病、减少死亡率和控制疾病的传播具有重要的意义。重组聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是一种新型的等温扩增技术,具有简单、快速、灵敏度和特异度高的特点,不需要复杂的设备和专业的操作人员。自从RPA技术被开发出来以后,该检测技术已应用于艾滋病、登革热、诺如病毒等多种病原体的检测,但目前还未将RPA技术应用于EV71的检测。本研究拟建立针对EV71-C4的逆转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)方法,并对其进行评价,以期建立一种可用于疾病暴发现场的EV71-C4的快速低成本的检测方法。方法以毒株 SZ/HK08-6(GenBank accession no.GQ279370.1)作为参考序列,针对VP1基因的保守区域设计引物和探针,筛选出最佳的引物和探针组合,建立EV71-C4的RT-RPA快速检测方法,并对其灵敏度、特异度和临床应用可行性进行评价。制备样本RNA标准品,同时使用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR检测系列稀释的样本RNA标准品,计算并比较三种方法的95%检测限。用柯萨奇病毒A组(CV-A2,-A4,-A5,-A6,-A9,-A10和-A16)、柯萨奇病毒B组(CV-B2,和-B4)、埃可病毒9和诺如病毒GIL17评价RT-RPA检测方法的特异度。同时用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR检测178份疑似手足口病的临床粪便样本,以RT-qPCR的检测结果作为金标准,将RT-RPA和RT-PCR的检测结果与RT-qPCR的检测结果进行比较,评价RT-RPA检测方法的临床应用价值。结果本研究所建立的EV71-C4RT-RPA检测方法,在40℃的条件下,反应时间≤1Omin。特异度为100%,只有阳性样本检测到了扩增信号,而特异性评价病毒和临床阴性样本均未检测到扩增信号。经概率元分析,可得RT-RPA、RT-qPCR和 RT-PCR 的 95%检测限分别为 3.767(95%CI,3.489 to 4.283)、2.026(95%CI,1.645 to 2.710)和 4.921(95%CI,4.628 to 5.382)LGC/反应。在临床样本的评价中,以RT-qPCR的检测结果作为金标准,44个份粪便样本的检测结果表明,RT-RPA检测方法灵敏度和特异度均为100%,而RT-PCR的灵敏度和特异度分别为90.0%(18/20)和91.7%(22/24)。基于另外134个粪便样品的测定结果表明,RT-RPA检测方法的灵敏度和特异度分别为89.5%(68/76)和100.0%(58/58),而RT-PCR的灵敏度和特异度分别为63.2%(48/76)and 89.7%(52/58)。RT-RPA检测方法的临床性能与RT-qPCR无显著性差别,但要优于RT-PCR。结论本研究建立的针对EV71-C4的RT-RPA检测方法,操作简单,反应时间短,在临床样本的检测中表现出了较高的灵敏度与特异度,适用于经济欠发达地区及传染病暴发现场的快速检测。
【图文】：

效果图,引物扩增,效果,检测限

图３－１引物扩增效果逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍｅｒｓ逡逑线邋１：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ２；线邋２：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ１；线邋３：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ２逡逑的阴性对照；线４：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ１的阴性对照逡逑３．２灵敏度分析逡逑将样本ＲＮＡ标准品系列稀释，溶度为６．４１１邋ｌｏｇｌＯ邋ｇｅｎｏｍｉｃ邋ｃｏｐｉｅｓ邋（ＬＧＣ）至ｌｊ逡逑０．４１１邋ＬＧＣ，总共有１２个稀释梯度。每种检测方法每个稀释梯度独立重复实验８逡逑次，检测结果如表３－３所示，表中记录的数据是阳性频数。经概率元分析得出逡逑ＲＴ－ＲＰＡ邋的邋９５％检测限及邋９５％可信区间为：３．７６７邋（９５％邋ＣＩ，邋３．４８９邋ｔｏ邋４．２８３）邋ＬＧＣ／逡逑反应。ＲＴ－ｑＰＣＲ邋９５％检测限及邋９５％可信区间为：２．０２６邋（９５％ＣＩ，１．６４５邋ｔｏ邋２．７１０）逡逑ＬＧＣ／邋反应。ＲＴ－ＰＣＲ邋９５％检测限及邋９５％可信区间为邋４．９２１邋（９５％邋ＣＩ，邋４．６２８邋ｔｏ逡逑５．３８２）邋ＬＧＣ／邋反应。逡逑表３－３不同检测方法检测限的比较逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－３邋Ｃｏｍａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｓｓａｓ逡逑

检测方法,临床应用,阳性对照,埃可病毒

３．３特异度分析逡逑检测结果表明，在特异性评价中，只有阳性对照有扩增信号，而特异度评逡逑价病毒株均未检测到扩增信号（图３－２）。逡逑２０．０００逦一－＾逦＊逡逑＾邋１６，０００邋／逡逑§邋１２．０００邋／逡逑ｇ逦／逡逑Ｓ邋８．０００逦／逡逑４．０００逦／逡逑ｙ逦２－ｉ３逡逑0，000逡逑０．００逦４．００逦８．００逦１２，００逦１６．００逦２０．００逦２４．００逦２８．００逦３２．００逦３６．００逦４０．００逡逑Ｃｙｃｌｅ逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｔｈｅ邋Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ邋ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＥＶ７１邋ＲＴ－ＲＰＡ邋ａｓｓａｙ逡逑图３－２邋ＥＶ７１邋ＲＴ－ＲＰＡ检测方法的特异度评价逡逑１：阳性对照；２－１３：柯萨奇病毒Ａ组（ＣＶ－Ａ２，－４，－５，－６，－９，，－１０，和－１６），柯萨逡逑奇病毒ＡＳ（ＣＶ－Ｂ２，和－４），埃可病毒９，诺如病毒ＧＩＩ．１７，阴性对照．逡逑３．４临床应用初步评价逡逑为了评估本实验建立的ＥＶ７１－Ｃ４邋ＲＴ－ＲＰＡ检测方法的临床应用性能，对１７８逡逑份疑似手足口病病人的粪便样本同时用ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＲＰＡ三种检测逡逑３１逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.1;R440

【参考文献】