基于链交换扩增新方法对肺炎支原体核酸快速检测方法的研究

发布时间：2020-05-07 09:24

【摘要】：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,拉丁语简称M.pneumoniae)是引起上呼吸道感染的主要病原菌之一,也是导致社区获得性肺炎的常见原因。随着近年来环境中空气质量下降,患有呼吸道感染疾病的人越来越多,呼吸道感染疾病诊断逐渐成为人们关注的焦点。由肺炎支原体引起的呼吸道感染与普通感冒症状并无差异,但如未及时诊断治疗可能会造成患者全身多处脏器损伤和器质性病变,严重者危及生命。因此,发展一种准确、快速的肺炎支原体检测方法是十分有意义的。本研究以肺炎支原体为研究对象,利用变性泡介导的链交换扩增(Denaturation bubble-meditated strand exchange amplification,SEA)方法对肺炎支原体进行核酸快速检测方法的研究,主要的研究内容与结论如下:1.痰液样品中肺炎支原体核酸提取方法比较研究:以肺炎支原体感染患者痰液为样本,将肺炎支原体感染患者痰液消化处理后通过苯酚-氯仿核酸提取法、磁珠核酸提取方法、离心柱核酸提取方法分别对等体积的痰液进行核酸提取并将提取液进行浓度、吸光度比值以及其他几个方面的评估,选取一种最优的肺炎支原体感染痰液核酸提取方法。结果表明:离心柱核酸提取方法提取核酸浓度范围为255.6-440.3ng/μL,磁珠核酸提取方法核酸浓度范围为110-186.9 ng/μL,苯酚-氯仿法提取核酸浓度范围为11.6-27.5 ng/μL。从OD260/280与OD260/230比值来比较三种核酸提取方法的核酸提取纯度,离心柱、磁珠与苯酚-氯仿三种核酸提取方法OD260/280比值范围分别为2.51-3.15、1.53-1.93、1.32-1.85。离心柱、磁珠与苯酚-氯仿三种核酸提取方法OD260/230比值范围分别为2.77-3.22、0.52-1.98、0.32-1.75。结论:通过三种方法对痰液中肺炎支原体核酸提取的浓度、吸光度比值、提取时间、扩增效率分析比较,离心柱核酸提取方法为三种提取方法中最优的核酸提取方法。2.基于链交换扩增新方法对肺炎支原体核酸快速检测方法的建立:以肺炎支原体为靶标,将SEA方法应用于肺炎支原体的检测,从该方法的引物设计、可行性、温度优化、灵敏性、特异性、结果可视化等方面进行研究,建立一种新型的肺炎支原体检测方法。结果表明,SEA方法检测肺炎支原体反应最适温度是61℃,最低检测限为1×10~4 copy/mL。引物具有良好特异性,可以与11种上呼吸道感染致病菌进行区分。通过向反应管中加入本实验室研制比色染料实现了该方法反应结果肉眼可视化。结论:SEA等温扩增新方法可以应用于肺炎支原体检测,检测限达到临床肺炎支原体感染最低检测标准,并且反应结果借助比色染料实现了可视化,不需要依赖大型的荧光PCR仪来观察结果。3.SEA方法检测实际样品与对比研究:利用SEA肺炎支原体检测方法与环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法分别对224例上呼吸道感染患者进行检测,比较三种方法对实际样品检测的准确性。SEA、LAMP、PCR检测方法针对224例上呼吸道感染痰液样品分别检测出38、41、42例肺炎支原体感染阳性样本,但LAMP方法在对实际样品检测中检出2例假阳性结果,三种方法准确率分别为90.50%、97.6%、100%。同时分析了三种方法在反应起峰时间、引物数量、检测限和反应温度等方面的不同点。结论:SEA检测肺炎支原体方法对上呼吸道感染实际样品检出率略低于PCR与LAMP方法,但该方法在引物数量,反应时间,反应条件等方面均具有自身优势。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R440

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