同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清孕酮与载脂蛋白B研究

发布时间：2020-05-08 14:33

【摘要】：目的:建立同位素稀释高效液相色谱串联质谱(Isotope Dilution Liquid chromatography tandem mass spectrometry,ID LC/MS/MS)测定血清孕酮的参考方法,并开展与常规免疫方法的比对研究,评价孕酮相关制备物的互通性,为我国临床实验室孕酮检测的标准化提供理论依据,并且为我国室间质量评价(External Quality Assessment,EQA)计划及标准化计划遴选合适的质评材料。方法:用配制的孕酮标准溶液和相关的干扰物摸索色谱质谱条件。前处理过程考察了固相萃取和液液萃取。方法确认过程评价了不精密度,正确度,回收率,基质效应,检测限和定量限,不确定度等指标。方法的应用包括与常规方法的比对以及评价参考物质的互通性。采用单人份血清作为方法学比对和互通性评价的样本,待评价的常规系统包括国内和国外品牌的主流分析系统,待评价互通性的物质有:(1)新鲜冰冻混合人血清;(2)有证标物;(3)动物血清;(4)室间质量评价质控材料;(5)市售第三方质控品;(6)去激素血清;(7)环糊精水溶液。以本研究所建的ID LC/MS/MS方法作为比对方法,其测定的新鲜冰冻血清样本结果为X轴,以5种常规方法测定结果为Y轴,运用最小二乘法(OLS)进行简单线性回归并计算双侧95%预测区间,通过比较剩余标准差与总分析不精密度,以及偏倚等,分析当前常规免疫学方法存在的主要问题;互通性评价采用了两种方法,分别为传统的统计学方法,即双侧95%预测区间和国际临床化学联合会(International Federation Of Clinical Chemistry,IFCC)推荐的偏倚差值法。结果:孕酮的液相色谱分离采用Waters Symmetry C18色谱柱(3.5μm,2.1 ×10Omm),流速0.2 mL/min,流动相为水(含0.01%乙酸):乙腈(v:v)=35:65,柱温25℃。此条件下孕酮的保留时间为5.50 min。在API 5000质谱仪,电喷雾离子源多反应监测模式下,选取m/z 315.4→109.2和m/z 318.4→112.4作为定量离子对,m/z 315.4→97.1和m/z 318.4→100.1作为定性离子对。确定的前处理过程为正己烷提取血清孕酮,再用环糊精提取,最后萃取到甲苯中,氮气下吹干,流动相重组后上样检测。最后用包括法定量。方法的批内和总不精密度分别为0.50%-0.58%,0.7%-1.33%。方法相对回收率为99.08%-101.50%。方法比对实验中,6种常规方法与ID LC/MS/MS方法拟合的回归方程的斜率范围为0.96-1.26,截距为-1.14-0.89 ng/mL。部分常规系统在低浓度下剩余标准差是分析不精密度的20倍。6个系统的偏倚范围为-0.20-4.06 ng/mL,相对偏倚在-1.40-18.85%。互通性评价方面,采用传统95%预测区间的方法,自制混合病人血清,国际冻干人血清标物ERM DA 347,BCR 348R,国内冰冻人血清标物GBW09197,09198,09199,以及商品化的去激素血清在6个系统上都具有互通性。环糊精水溶液明显超出预测区间的下限。使用IFCC推荐的偏倚差值法进行互通性评价时,没有一个制备物在6个系统上都表现出互通性。结论:本研究建立了孕酮的同位素稀释液相色谱串联质谱法,方法检测时间短,结果准确可靠。依据建立的方法,对常规免疫方法进行评价,发现多数免疫方法存在校准偏倚和特异性问题。通过对制备物互通性的评价,发现新鲜冰冻混合人血清在6个评价的系统中均具有良好的互通性。IFCC推荐的偏倚差值法与95%PI方法的互通性评价结果有一定差异。目的:研究血清载脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)和特定apoB肽段胰蛋白酶酶解过程,考察蛋白或肽段酶解动力学,优化apoB肽段液相色谱质谱分析条件,探索蛋白类检验项目准确定量时的样本制备程序,为蛋白质的参考测量研究提供实验基础。方法:根据相关文献及数据库选择4种apoB的特异性片段(目标肽段)。人工合成目标肽段、同位素标记目标肽段(用作内标)。利用合成的目标肽段优化色谱质谱分析条件。将血清适量内标混合,在不同酶解条件(胰蛋白酶制剂种类、用量及酶解过程和温度等)下反应不同时间,经脱盐等处理后进行色谱质谱分析,记录目标肽段和内标肽段的绝对峰面积,计算峰面积比值,分析绝对峰面积和峰面积比值随时间的变化。结果:本研究选定的特异性片段及其内标分别为TEVIPPLIENR,TGISPLALIK,SVSLPSLDPASAK,FPEVDVLTK 和 TEVIPPL*IENR,TGISPL*ALIK,SVSLPSL*DPASAK,FPEVDVL*TK(*代表同位素标记的氨基酸,使用13C和15N同时标记了该氨基酸的6个C和1个N)。研究发现不同种类的酶对水解效率有很大影响,进而影响整个反应的时间。通过选择合适的胰蛋白酶,在70℃反应条件下,目标肽段在30miin内即可达到最大绝对峰面积,峰面积比也达到最大值。在血清样本中,4h内目标肽段的绝对峰面积稍有下降趋势,其中一个肽段(TGISPLALIK)及其同位素内标肽段的绝对峰面积下降比较明显,达70%。在30min到4h的反应时间内,四个肽段的同位素比基本保持稳定。结论:本实验初步研究了液相色谱质谱法测定apoB色谱质谱参数和样本制备条件,通过选择合适的胰蛋白酶,优化反应条件,可以在30min内达到最大的水解程度。该结果提示使用目标肽段作为校准品的可行性,有望通过进一步的氨基酸分析实现向国际单位制(SI)的溯源,从而实现复杂大分子蛋白的准确定量。
【图文】：

母离子,孕酮,质谱图

范围ｍ／ｚ：邋２７０－３７０，驻留时间：０．２ｓｅｃ，调节质谱仪各参数，发现影响最大的参数逡逑是ＤＰ。ＤＰ太高可能会造成待测物的源内裂解，选择不到合适的母离子，适当调节逡逑ＤＰ和其他参数，使母离子响应强度增高，，最后选定母离子为３１５．４，见下图２。逡逑１．３ｅ７逡逑１２６７逦Ａ逡逑１．１ｅ７邋ｉ逦【＿】＋逡逑Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ邋ｉｏｎ，邋３１５．４逡逑１．０ｅ７逡逑９．０ｅ６逡逑８．０ｅ６逡逑＾逦７．０ｅ６逡逑Ｉ邋６．０ｅ６逡逑ｏ逡逑Ｓ邋５．０ｅ６逡逑４．０ｅ６逡逑３．０ｅ６１逡逑２．０ｅ６逦Ｉ逦３１邋＇＇逡逑00＞邋＾ｐｌ．Ｔｆｒｉ邋ｉ２Ｈｋｆｒｉ４邋ｕ邋ｉ邋．ｉ邋ｕ＼ｕ，逦ａ．ｐｆｉ邋３３２ＡＪ．．ｆ．３１３邋．ｗｆＭ．ｆ１２．邋ｆｆｎ，．逡逑２７０逦２８０逦２９０逦３００逦３１０逦３２０逦３３０逦３４０逦３５０逦３６０逦３７０逡逑ｍ／ｚ，邋Ｄａ逡逑图２孕酮母离子质谱图。逡逑对选定的母离子３１５．４进行Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｉｏｎ模式扫描，选定两个响应强度相对逡逑较高的离子作为Ｑ３

孕酮,子离子,质谱图,母离子

图２孕酮母离子质谱图。逡逑对选定的母离子３１５．４进行Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｉｏｎ模式扫描，选定两个响应强度相对逡逑较高的离子作为Ｑ３，分别为９７．１；邋１０９．２，如下图３：逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6;O657.63

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