骨髓间充质干细胞移植减少缺血诱导的血脑屏障破坏

发布时间：2020-05-09 16:29

【摘要】：背景与目的:缺血性卒中诱导基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活化,其通过降解胞外基质增加了血脑屏障通透性。作为干细胞治疗中的常用细胞,间充质干细胞(MSCs)具有治疗缺血性脑损伤的巨大潜力。已有研究表明,骨髓间充质干细胞移植可减少缺血急性期血脑屏障破坏并改善动物神经功能,然而其分子机制并不完全清楚。本研究中,我们检测了缺血性脑损伤后骨髓间充质干细胞是否可通过影响基质金属蛋白酶-9的释放和活化而对维持血脑屏障功能有积极作用,并进一步探讨了与其可能相关的分子机制。我们假设间充质干细胞可通过抑制细胞间粘附因子(ICAM-1)的表达,减少嗜中性粒细胞粘附、浸润和迁移,从而减少由嗜中性粒细胞引起的自身与其他细胞的基质金属蛋白酶-9释放,以减轻血脑屏障破坏。材料与方法:选取118只成年雄性ICR小鼠,采用线栓法对其进行短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)90分钟,拔掉线栓后20分钟内,在小鼠缺血半暗带纹状体区域,立体定位注射骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)。在体实验分为四个组:假手术组,缺血+生理盐水组,缺血+干细胞组及缺血+SB-3CT(阳性对照)组。造模后1天和3天时对动物进行神经行为学评分。牺牲动物后取脑测定栓塞体积和血脑屏障通透性情况,研究基质金属蛋白酶-9含量水平及活性情况。然后测定嗜中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶活力。我们也研究了细胞间粘附因子-1(ICAM-1)分泌的变化。体外实验中,我们使用骨髓间充质干细胞及其条件培养基与进行糖氧剥夺(OGD)后的bEnd.3细胞共培养以模拟在体的缺血再灌注,并检测细胞间粘附因子-1的变化及其可能涉及的通路。结果:相比于生理盐水组,干细胞治疗组的小鼠神经功能缺陷评分,梗死体积,免疫球蛋白G渗出都显著下降(p0.05)。干细胞治疗减少了紧密连接蛋白occludin、ZO-1和claudin-5的间隙,及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达(p0.05)。干细胞治疗也减少了嗜中性粒细胞浸润数量和降低了髓过氧化物酶活性(p0.05)。此外,我们也证明了干细胞治疗能有效抑制缺血后基质金属蛋白酶-9蛋白和mRNA水平的上调及活力升高,并减少细胞间粘附因子-1的表达(p0.05)。同时,作为阳性对照应用SB-3CT抑制基质金属蛋白酶-9后,可观察到基质金属蛋白酶-9下调。体外实验应用干细胞及其条件培养基分别与进行糖氧剥夺处理后的bEnd.3细胞共培养,证明了干细胞治疗能减少缺氧缺糖诱导的细胞间粘附因子-1表达及单腺苷酸蛋白激酶的磷酸化。使用单腺苷酸蛋白激酶的抑制物补体C能有效抑制干细胞共培养引起的单腺苷酸蛋白激酶磷酸化。结论:缺血后间充质干细胞移植能通过影响基质金属蛋白酶-9,减轻小鼠缺血性脑损伤后血脑屏障破坏,可能是通过减少内皮细胞细胞间粘附因子-1表达,继而减轻嗜中性粒细胞的粘附与浸润,最后影响其与其他细胞分泌基质金属蛋白酶-9。另外,体外实验提示了间充质干细胞可能是通过单腺苷酸蛋白激酶通路下调细胞间粘附因子-1的表达,这是干细胞旁分泌行为的重要因素之一。研究提示了间充质干细胞治疗缺血性卒中时基质金属蛋白酶-9是一个新的重要靶点。
【图文】：

上海交通大学硕士学位论文上清，用磷酸盐缓冲液洗一遍； 300 微升磷酸盐缓冲液重悬于流式专用离心管中；仪上机；使用 Flowjo_V10 进行分析。质干细胞培养与形态微镜下观察从 SD 大鼠股骨和胫骨骨髓中分离培养得细胞贴壁后呈不规则形状，逐渐长为长梭形。待逐渐代数增多，细胞形态一致性增加，见图 1。

图 2. 流式细胞仪分析结果Figure 2. Results of cell identification体外培养的细胞 99.99%以上呈 CD29 和 CD90 阳性且 CD31 和 CD45 阴性。1.3.3 骨髓间充质干细胞示踪为了观察注射入脑内纹状体区域的细胞存活状态，，我们使用活细胞染料 CFDA对注射进脑内的细胞进行荧光标记。注射三天后取脑冰冻切片，在激光共聚焦显微镜观察到细胞注射于纹状体区域并有些许迁移，同时多数细胞的细胞核圆润清晰，表明胞存活，见图 3。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R457.7;R743.3

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本文编号：2656415