生物标志物电化学传感检测新方法研究

发布时间：2020-05-10 14:38

【摘要】：近年来,受生活习惯、饮食结构以及环境等因素影响,癌症、慢性病等已成为困扰人类健康的主要杀手,因此,开展生物体内疾病相关标志性生物分子分析检测可以为疾病诊断以及预后判断提供可靠、强大的检测和监控策略,具有十分重要的生物医学意义。然而,实际生物样品中生物分子浓度动态分布范围宽,而与疾病相关的生物标志物却往往表现为低丰度,因此,发展更多低丰度功能生物分子研究新策略与新方法,对于实现目标分析物的快速、灵敏、准确分析检测,揭示生命活动发生与发展规律,进而指导疾病的诊断与治疗具有十分重要的科学意义。而电化学生物传感器因其仪器设备简单、操作简便、分析速度快、检测通量高等优点,成为生命分析领域最有发展前途的分析技术之一,在生物标志物分析检测方面具有广阔的应用前景。本论文综合运用生物纳米探针本身的结构特征、识别特性、生物酶放大、以及核酸识别与组装原理,合理设计识别探针,开发信号扩增新模式,探索构建特异性识别及信号转导新平台,发展了一系列蛋白质、核酸等疾病相关生物标志物生物传感新策略。主要包括以下三个部分:1、基于双酶辅助多重放大策略的多功能免标ctDNA电化学生物传感器研究基于核糖核酸酶HII(RNase HII)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)双酶辅助多重放大策略,设计构建了多功能免标循环肿瘤DNA(ctDNA)超灵敏电化学传感平台。独特设计的三链核酸探针作为识别捕获单元,在RNase HII辅助下实现目标均相循环扩增和信号转导探针(STP)释放。通过电极界面捕获STP,并引发TdT介导一级延伸,形成DNA“树干”。辅助探针(AP)与“树干”结构部分杂交引发TdT介导二级延伸,由此产生稳定的DNA树枝状结构,最终得到电活性分子亚甲基蓝(MB)标记的电活性树,达到对ctDNA的灵敏和精准检测。该方法将三链分子开关(THMS)高效识别、RNase HII辅助循环放大和TdT介导级联扩增相结合,实现目标物多重扩增和高灵敏检测,其检测范围为0.01 fM-1 pM,检出限低至2.4 aM。更重要的是,该传感平台只需通过改变RP环部序列就可以很容易实现对其它ctDNA的通用性检测。因此,该策略为ctDNA的检测提供了多功能通用化工具,具有通用型基因相关分子诊断的潜力。2、基于Pt/UiO-66的磷酸化蛋白电化学检测平台研究基于Pt/UiO-66功能复合材料,构建了磷酸化蛋白电化学检测平台。首先合成了结合Pt纳米粒子优异电催化活性与UiO-66良好的磷酸化蛋白分离富集能力的Pt/UiO-66复合材料,通过TEM、SEM、XRD、TGA、N_2吸附-脱附等实验手段对制得材料的形貌、微观结构、热稳定性等性能进行了表征,证实制备的Pt/UiO-66表面分布均匀,热稳定性和化学稳定性良好。通过复合材料中UiO-66发挥磷酸化蛋白识别富集功能,富集的磷酸蛋白会覆盖材料表面Pt纳米粒子进而影响复合材料催化H_2O_2还原的电催化活性,实现电化学磷酸蛋白定量分析策略。实验结果证明,该传感平台对磷酸化蛋白?-Casein和?-Casein表现出较好的选择特异性,检测范围分别为0.1 ng ml~(-1)-1 mg ml~(-1)、0.01 ng ml~(-1)-0.1 mg ml~(-1)。该策略为磷酸化蛋白定量分析提供了较好的方法,有望在磷酸化蛋白组学和临床标志物分析中发挥潜力。3、基于浮选分离协同T7辅助放大策略的均相ctDNA比例电化学生物传感器研究基于功能化浮力微球探针和T7核酸外切酶(T7 Exo)辅助放大策略,设计构建了高灵敏均相ctDNA比例型电化学传感平台。该体系首先构建基于识别探针条形码的浮力微球,目标分子的存在引发微球负载捕获探针(CP-Fc)释放,并在T7 Exo辅助下实现目标循环放大。随后加入的发夹探针(HP-MB)会与微球中裸露辅助探针(AP)杂交,最终在T7 Exo再次作用下引发均相比例信号放大体系,最终使得I_(Fc)/I_(MB)与目标分子浓度呈现一定的相关性,实现对目标ctDNA的超灵敏检测。该传感平台可对ctDNA PIK3CA E542 KM实现高灵敏检测,其检测范围为0.01 fM-1 pM,检出限低至9.23 aM。该策略中的优越性概括如下:(I)浮选分离及均相非界面的识别体系避免了电极界面修饰的繁琐步骤,并且可以最大限度保持生物分子的空间自由度,有利于实现高效分子识别事件;(II)双信号报告结果模式可以有效避免非特异性引发的假阳性与假阴性信号;(III)浮选分离概念的引入有望实现无需借助外力的极简检测理念,有望快速推广于Point-of-Care检测领域,为电化学传感检测提供新方法。
【图文】：

聊城大学硕士学位论文 1.1 所示。该生物传感器构建的 poly A 捕获探针 polyA-P 由识别区和别区可以特异性捕获靶标 DNA 并与之杂交，锚定区 polyA 可以与金两者间亲和力与金硫键相当。通过改变 polyA 段长度轻松控制探针表得高信噪比。该传感器检出限可低至 5 fM，表现出优异的重现性和稳“夹心型”电化学 DNA 生物传感器相当。

亲和力与金硫键相当。通过改变 polyA 段长度轻松控制噪比。该传感器检出限可低至 5 fM，表现出优异的重现”电化学 DNA 生物传感器相当。图 1.1 基于聚腺嘌呤 DNA 自组装的电化学 DNA 传感器[37]
【学位授予单位】：聊城大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446;TP212.2

【参考文献】

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1 刘洁琼;贺智敏;;磷酸化蛋白质组学技术及其在肿瘤研究中的应用[J];中南大学学报(医学版);2008年07期

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本文编号：2657458