铜绿假单胞菌和大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药及机制研究

发布时间：2020-05-12 19:09

【摘要】：目的:异质性耐药(Heteroresistance,HR)是细菌由敏感状态进化至耐药状态的中间阶段和必经过程,但其产生原因尚不明确。本研究探讨了碳青霉烯异质性耐药铜绿假单胞菌(CarbapenemheteroresistancPseudomonas aeruginosa,CHPA)的分子流行病学、耐药机制、患者独立危险因素和临床转归,以及大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药(Carbapenemheteroresistanc Escherichia coli,CHEC)的分子机制,以便更好的了解CHR在不同菌种间的发生发展过程。方法:回顾性收集重庆医科大学附属第一医院2011年1月到2015年12月无菌体液中分离的非重复铜绿假单胞菌451株,Vitek2 Compact系统完成菌株药敏实验,纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B 法)、菌落谱型分析(Population Analysis Profile,PAP)和Time-Killing实验完成异质性耐药表型检测,脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)完成CHR菌株同源性检测及分子流行病学特征分析;微量肉汤稀释法检测异质性耐药原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群的MIC值,RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR)方法检测异质性耐药原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群的外排泵基因、膜孔蛋白基因和产AmpC酶基因表达水平;统计临床资料并运用SPSS.21软件分析CHR菌感染的独立危险因素及CHR发生率与碳青霉烯抗生素使用量的相关性。此外,K-B法初筛E.coli对亚胺培南(Imipenem,IPM)异质性耐药表型,并经菌落谱型分析实验证实;PCR(Polymerase chain reaction)扩增及测序的方法检测亚胺培南异质性耐药大肠埃希菌(IPM-heteroresistant,IPM-HR)中与碳青霉烯耐药有关的基因,包括碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs)基因和膜孔蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)基因;基因替换技术进行膜孔蛋白OmpF突变序列的替换,并进行相关验证。结果:1、铜绿假单胞菌碳青霉烯异质性耐药及机制研究结果如下:(1)统计K-B法药敏结果发现:P.aeruginosa对IPM的药敏情况为:异质性耐药菌株245株(占54.3%),敏感菌株126株(占27.9%),耐药菌株69株(占15.3%),中介菌株11株(占2.5%)。而对MEM的药敏情况分别为:异质性耐药菌株327株(72.5%),敏感菌株76株(16.9%),耐药菌株40株(8.7%),中介菌株8株(1.9%)。进一步分析2011年到2015年无菌体液分离的451株铜绿假单胞菌的异质性耐药率,发现MEM的异质性耐药率为72.5%,明显高于IPM的54.3%,且IPM和MEM的异质性耐药率逐年增加。(2)CHPA菌同源性分析结果显示:异质性耐药菌原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群PFGE谱型一致;而99株临床CHR菌株间PFGE谱型各异,并未出现3株及以上PFGE谱型相同的菌株。(3)CHPA耐药机制研究:异质性耐药原始菌与其耐药亚群的MIC值呈现8倍或16倍差异。与原始菌相比,IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的AmpC基因表达分别增高了 1.04-1.32倍和1.14-1.43倍,但无统计学差异(P0.05);IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的外排泵基因表达均有所增高,但发现IPM-HR耐药亚群的MexB和MexE基因表达分别增高了 1.58-1.78倍和1.96-2.64倍,MEM-HR耐药亚群的MexB基因表达增高了 1.74-2.12倍,且有统计学差异(P0.05);IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的膜孔蛋白OprD基因表达下调了 0.56-0.12倍(P0.05)。(4)危险因素分析结果显示:男性、引流管和先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR菌感染的独立危险因素;而转院和先前使用碳青霉烯抗生素是MEM-HR菌感染的独立危险因素;先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR和MEM-HR菌感染的共同独立危险因素。进一步分析IPM-HR发生率与碳青霉烯类抗生素使用量呈正相关,有统计学意义(P0.001,r2=0.941),MEM-HR发生率与碳青霉烯类抗生素使用量也呈正相关,差异也有统计学意义(P0.001,r2=0.918)。2、E.coli碳青霉烯异质性耐药机制研究结果如下:(1)K-B药敏结果发现大肠埃希菌N8591为IPM-HR菌并经PAP实验证实;该菌株对氨曲南、环丙沙星、庆大霉素、三代头孢和四代头孢菌素等绝大部分抗生素耐药,对厄他培南为低水平耐药(MIC值为2μg/mL),而对亚胺培南为异质性耐药。(2)对该菌株耐药基因检测发现其不表达blaaKPC、blaNDM-1、blaIMP和blaVIM等产碳青霉烯酶基因;检出ESBLs基因blaCTX-M-3;膜孔蛋白OmpF基因在序列788位点共发生19个碱基缺失,打乱了其阅读框架,导致膜孔蛋白OmpF缺失。(3)成功将N8591菌的OmpF突变序列替换到标准菌株ATCC25922的OmpF上,通过K-B药敏实验发现替换后的菌株ATCC25922/WompF株也出现IPM异质性耐药表型并得到PAP实验证实。随机选择4株IPM-HR菌,PCR扩增OmpF基因并测序比对,发现这4株菌的OmpF基因并未发生与N8591菌OmpF基因相同突变。结论:异质性耐药现象普遍存在,其发生机制可能也是多样复杂的:1、铜绿假单胞菌对IPM和MEM存在高异质性耐药率,这些临床菌株间未存在暴发流行情况,膜孔蛋白OprD基因表达下调合并外排泵基因表达增强是其主要耐药机制,而先前使用碳青霉烯类抗生素是CHPA菌感染的共同的独立危险因素。2、膜孔蛋白OmpF缺失可能是大肠埃希菌IPM-HR现象产生的机制之一。
【图文】：

曲线,铜绿假单胞菌,耐药

逡逑其为非异质性耐药（见图１．１中的Ａ和Ｃ），可分为敏感、中介和耐药；而在抑菌逡逑圈内存在有大小不等的细菌菌落生长，则可初步判定其为异质性耐药（见图１．１中逡逑的Ｂ和Ｄ）。逡逑ＤＯ逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑图１．１铜绿假单胞菌ＩＰＭ和ＭＥＭ的Ｋ－Ｂ法结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｋ－Ｂ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＰＭ邋ａｎｄ邋ＭＥＭ邋ｉｎ邋Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ逡逑３．２异质性耐药菌株的确认逡逑ＰＡＰ实验和Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ实验均是判定实验菌株是否存在耐药亚群的方法，以逡逑下是其判定标准，（１）邋ＰＡＰ实验：细菌在最高非抑菌抗生素浓度到最低完全抑菌逡逑抗生素浓度之间大于等于８倍关系，当可证实为异质性耐药现象［９］）。（２）逡逑Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ实验：细菌在４倍菌株的ＭＩＣ值抗生素作用下菌落出现先下降后重新逡逑再生长，可证实菌株中存在耐药亚群。从图１．２中ＰＡＰ曲线可以看出异质性耐药逡逑菌株在对ＩＰＭ和ＭＥＭ均出现了大于等于８倍的折点，而敏感菌株和耐药菌株则逡逑没有，从Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ曲线可看出，敏感菌株没有出现再生长现象，而异质性耐药逡逑菌株则出现了先杀死敏感亚群

曲线,铜绿假单胞菌,曲线分析,耐药

逡逑其为非异质性耐药（见图１．１中的Ａ和Ｃ），可分为敏感、中介和耐药；而在抑菌逡逑圈内存在有大小不等的细菌菌落生长，则可初步判定其为异质性耐药（见图１．１中逡逑的Ｂ和Ｄ）。逡逑ＤＯ逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑图１．１铜绿假单胞菌ＩＰＭ和ＭＥＭ的Ｋ－Ｂ法结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｋ－Ｂ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＰＭ邋ａｎｄ邋ＭＥＭ邋ｉｎ邋Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ逡逑３．２异质性耐药菌株的确认逡逑ＰＡＰ实验和Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ实验均是判定实验菌株是否存在耐药亚群的方法，以逡逑下是其判定标准，（１）邋ＰＡＰ实验：细菌在最高非抑菌抗生素浓度到最低完全抑菌逡逑抗生素浓度之间大于等于８倍关系，当可证实为异质性耐药现象［９］）。（２）逡逑Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ实验：细菌在４倍菌株的ＭＩＣ值抗生素作用下菌落出现先下降后重新逡逑再生长，，可证实菌株中存在耐药亚群。从图１．２中ＰＡＰ曲线可以看出异质性耐药逡逑菌株在对ＩＰＭ和ＭＥＭ均出现了大于等于８倍的折点，而敏感菌株和耐药菌株则逡逑没有，从Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ曲线可看出，敏感菌株没有出现再生长现象，而异质性耐药逡逑菌株则出现了先杀死敏感亚群
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】