响应面法在优化酶试剂盒测量条件中的应用研究

发布时间：2020-05-25 18:32

【摘要】：目的:结合酶催化活性浓度测量的特点,选择三个酶学项目,采用响应面法(RSM)在较少的实验次数下获得各项目的最佳试剂条件、测量条件及重要影响因素间交互作用情况的信息,以期在酶学标准化试剂盒研制中获得最优性价比。方法:(1)酶学标准化试剂盒研制项目选择临床常规检验测量频次较高的三个酶学项目:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP);方法学原理与国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)推荐的酶学参考方法基本一致;样本选择北京航天总医院检验科血清样本和参考实验室外部质量控制(RELA)样本,编号2016Rela-A和2016Rela-B;ALT和GGT项目参考物质选择欧洲标准局(IRMM)欧洲参考物质(ERM),ALP项目选择日本临床实验室标准委员会(JCCLS)有证参考物质(CRM)。(2)采用单因素分析法筛选各酶学项目影响测量结果的重要因素、确定实验区域即各影响因素量化后数值变化范围。(3)根据单因素分析法确定的重要影响因素和实验区域,采用RSM常用的Box-Behnken设计方式确定不同的实验条件和/或测量条件组合。(4)在安捷伦CARY100紫外、可见分光光度计上按Box-Behnken设计获得的实验条件和/或测量条件组合配制相应的试剂并设置参数,测量血清样本。(5)采用Minitab16软件分析,建立RSM模型即获得各酶学项目测量结果与重要影响因素之间的函数关系式,预测重要影响因素的理论最佳值。(6)固定除重要影响因素外的其他实验条件,按重要影响因素的理论最佳值配制试剂并设置参数,测量RELA样本,若结果符合国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)要求(合格范围±5.25%),RSM模型验证通过,否则根据验证结果调整实验区域后重新实验。(7)RSM模型验证通过后,在日立全自动生化分析仪7180上进行正确度验证,若测量结果满足参考物质测量不确定度(MU)的要求,则正确度验证通过。结果:(1)单因素方差分析结果表明ALT项目各浓度组间差异有统计学意义(P0.01);GGT项目各浓度组间差异有统计学意义(P0.01);ALP项目各浓度组间差异有统计学意义(P0.01)。确定各酶学项目影响测量结果的重要影响因素分别为ALT:反应液p H值、L(+)-丙氨酸浓度、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(β-NADH)浓度;GGT:反应液p H值、甘氨酰甘氨酸浓度、L-γ-谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺浓度;ALP:反应液p H值、磷酸对硝基苯酚(4-NPP)浓度、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)浓度。确定实验区域分别为ALT:反应液p H值(7.05-7.25)、L(+)-丙氨酸浓度(450mmol/l-550mmol/l)、β-NADH浓度(0.13mmol/l-0.23mmol/l);GGT:反应液p H值(7.6-7.8)、甘氨酰甘氨酸浓度(140mmol/l-160mmol/l)、L-γ-谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺浓度(4.5mmol/l-5.5mmol/l);ALP:反应液p H值(10.0-10.4)、4-NPP浓度(14mmol/l-18mmol/l)、AMP浓度(700mmol/l-800mmol/l)。(2)将各酶学项目重要影响因素设置为自变量A、B、C,响应值即测量结果设置为因变量Y,获得RSM函数关系式分别为ALT:Y=126.600+2.799A+0.956B+1.048C-6.951A2-3.169B2-3.556C2+0.215AB+0.062AC-0.887BC;GGT:Y=161.607+3.574A+1.221B+1.337C-8.873A2-4.046B2-4.539C2+0.275AB+0.079AC-1.132BC;ALP:Y=404.582+8.947A+3.056B+3.348C-22.212A2-10.128B2-11.365C2+0.688AB+0.198A C-2.834BC。(3)RSM模型预测各酶学项目重要影响因素理论最佳值分别为ALT:反应液p H值7.17、L(+)-丙氨酸浓度505.69mmol/l、β-NADH浓度0.17mmol/l;GGT:反应液p H值7.72、甘氨酰甘氨酸浓度146.80mmol/l、L-γ-谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺浓度5.06mmol/l;ALP:反应液p H值10.24、4-NPP浓度15.83mmol/l、AMP浓度747.28mmol/l。(4)RSM模型验证结果为ALT:2016Rela-A偏移+0.48%,2016Rela-B偏移+0.92%;GGT:2016Rela-A偏移+0.30%,2016Rela-B偏移+0.85%;ALP:2016Rela-A偏移+1.70%,2016Rela-B偏移-0.41%;各项目偏移幅度均可达到IFCC±5.25%的要求。(5)正确度验证结果与参考物质靶值相对偏移分别为ALT:-0.81%,满足±2.50%参考物质MU要求,GGT:-1.19%,满足±2.10%参考物质MU要求,ALP:-2.41%,满足±3.06%参考物质MU要求。结论:本研究成功建立了ALT、GGT和ALP三个酶学项目的RSM模型,有效弥补了传统单因素分析法的不足,以较少的实验次数获得了最佳测量条件。这一研究大大提高了实验效率,为推进检验医学的标准化和一致化工作奠定了基础,同时也为其他体外诊断检测试剂盒研发过程中实验条件优化提供了新的思路和参考。
【图文】：

趋势图,影响因素,催化活性,趋势图

表 8 ALT 项目各影响因素不同水平设计影响因素水平 1 水平 2 水平 3 水平 4 水平 5pH 值 7.05 7.10 7.15 7.20 7.25)-丙氨酸（mmol/l） 450 475 500 525 550ADH（mmol/l） 0.13 0.155 0.18 0.205 0.231.1.2 ALT 项目单因素分析单因素方差分析结果表明反应液 pH 值、L(+)-丙氨酸浓度、β -NADH 浓度三个因素对 ALT 酶催化活性浓度的影响在不同组间具有统计学意义（P=3.70×10-7），因此，所选定的三个影响因素均为重要影响因素[23,32]。绘制各影响因素与催化活性浓度测量结果的趋势图，见图 6。可见单因素实验所在实验区域可包括 ALT 最高催化活性，因此可将水平 3 设置为 RSM 设计中心点[22,32]。

趋势图,影响因素,催化活性,趋势图

表 14 GGT 项目各影响因素不同水平设计影响因素水平 1 水平 2 水平 3 水平 4 水平 5pH 值 7.6 7.65 7.7 7.75 7.8甘氨酰甘氨酸（mmol/l）140 145 150 155 160L-γ -谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺（mmol/l）4.5 4.75 5.0 5.25 5.52.1.2 GGT 项目单因素分析单因素方差分析结果表明反应液 pH 值、甘氨酰甘氨酸浓度、L-γ -谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺浓度三个因素对 GGT 酶催化活性浓度的影响在不同组间具有统计学意义（P=7.91×10-5），，因此所选定的三个影响因素均为重要影响因素。绘制各影响因素与催化活性浓度测量结果的趋势图，见图 11，可见单因素实验所在实验区域可包括 GGT 最高催化活性。因此可将水平 3 设置为 RSM 设计中心点[22,32]。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446

【参考文献】