携带人白细胞介素29基因的5型腺病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2020-05-29 08:51

【摘要】：目的:癌症是环境因素、遗传因素等多因素共同作用下引起细胞异常增殖所致,其分子学基础是DNA突变导致基因表达调控体系的失衡。肿瘤的治疗方法除三大传统疗法:手术、化疗和放疗之外,包括基因治疗和免疫治疗在内的生物治疗等治疗方法也正在迅速发展中。因为单一治疗方法难以有效延长中晚期肿瘤患者生存期,因此多种治疗方法联合治疗是临床医生常用的治疗方案。食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。我国食管癌的发病率和死亡率均居世界首位,每年约20多万人死于食管癌。食管癌发病机制较复杂,且多种调控因子共同参与细胞癌变。对于临床分期较早的患者,根治性手术是首选的治疗方法。但部分患者确诊时已到中晚期,或者一些高龄老年患者已无法耐受手术治疗,而基因治疗和免疫治疗为联合放化疗提供了可行性的选择方案。近年来,随着分子生物学研究的不断进展,基因治疗已逐渐应用至临床治疗中。基因治疗成功与否极大程度上取决于治疗基因能否被有效传递,因此,基因治疗需要有效的载体。目前比较成熟的病毒载体主要有腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒及痘苗病毒等,均已被广泛地应用于基因治疗的动物或临床研究中。因腺病毒载体具有只表达目的基因且不产生病毒、安全性高等优点,故本研究中采用腺病毒作为目的基因的载体。人白细胞介素-29(interleukin-29,IL-29)基因位于19号染色体长臂(19q13.13),其mRNA全长856 bp,其开放阅读框为603 bp,它是IL-10细胞因子超家族的一员。IL-29的生物学功能主要有抗病毒、抗增殖以及免疫调节等。但鉴于细胞因子在临床应用的弊端,即细胞因子分子量较小和作用半衰期短等应用限制性,本研究旨在对IL-29基因通过分子克隆技术进行重组,构建携带IL-29基因的5型腺病毒载体(pAd5-IL-29),制备重组腺病毒(Ad5-IL-29),并探究Ad5-IL-29在食管癌细胞系介导的抗增殖作用及其初步机制。本研究将为Ad5-IL-29介导的食管癌基因治疗的临床前研究提供实验基础和理论依据。方法:1 pAd5-IL-29的构建:根据IL-29基因可被诱导表达,用干扰素诱导剂poly I:C刺激HaCaT细胞,经RT-PCR方法扩增目的基因即IL-29基因片段,纯化回收PCR产物。将IL-29基因片段与pCR2.1质粒载体连接,连接产物经Nhe I酶和Hind III酶双酶切鉴定及基因测序。用Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到的IL-29基因片段,将其构建入经同种酶切的穿梭载体pShuttle2中,转化扩增后提取质粒pShuttle2-IL-29。用Hinc II酶和Nco I酶分别酶切pShuttle2-IL-29进行酶切鉴定。用I-Ceu I酶和PI-Sce I酶双酶切质粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,质粒pShuttle2-LacZ和pShuttle2-IL-29的酶切产物分别与pAd5的酶切产物连接,Swa I酶分别消化连接产物,转化扩增后分别提取质粒pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。Hind III酶酶切pAd5-LacZ和pAd5-IL-29进行酶切鉴定。2 pAd5-IL-29转染293细胞及Ad5-IL-29的制备:携带有编码LacZ和IL-29基因序列的腺病毒载体分别经Pac I酶酶切后,用脂质体法分别转染到包装细胞人肾上皮细胞系293细胞中,待病理性细胞死亡效应出现后,提取病毒即分别携带有编码LacZ和IL-29基因序列的重组腺病毒Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,共三次感染293细胞后,即大量扩增病毒至需要量。用Adeno-X~(TM) virus purification kits(BD Biosciences,Clontech)纯化Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,50%组织培养感染剂量法(tissue culture infective dose,TCID_(50))测定病毒滴度。用KARBER公式计算病毒滴度:T=10~(1+d(s-0.5))。3 Western Blot方法鉴定IL-29的表达:将对照组Ad5-LacZ和实验组Ad5-IL-29以MOI=3000感染食管癌细胞YES2,收集上清,煮沸变性后,经SDS-PAGE后转膜,5%脱脂奶粉封闭,单克隆抗体anti-hIL-29(RD Systems)及相应二抗孵育后ECL显影。4细胞增殖率检测:对照组Ad5-LacZ与实验组Ad5-IL-29分别以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0、30、100、300、1000和3000感染不同的食管癌细胞TE1、TE2、TE10、YES2、YES5和YES6,每个样本3个重复实验,用酶标仪于450 nm波长处读取OD值。根据测定的OD值,计算细胞增殖率。5流式细胞仪检测细胞周期改变:对照组Ad5-LacZ与实验组Ad5-I L-29分别以MOI=3000感染食管癌细胞YES2,每个样本3个重复实验,于培养后24 h和48 h,经碘化丙啶染色,用流式细胞仪分析细胞周期改变情况。6应用SPSS 21.0软件进行统计学分析,对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验,数据资料用均数±标准差(Mean±SD)表示,方差齐的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齐的数据则采用非参数检验,需要进一步比较的数据组以最小显著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作两两比较,每组实验不少于3个独立的重复样本,P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1 pAd5-LacZ和pAd5-IL-29的构建克隆IL-29基因并构建质粒pCR2.1-IL-29,经测序鉴定,IL-29基因序列与GenBank公布的基因序列一致(IL-29:AY129150);经Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到IL-29基因片段,并将其亚克隆入经同种酶酶切的穿梭载体pShuttle2中。I-Ceu I酶和PI-Sce I酶双酶切质粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,pShuttle2-IL-29和pShuttle2-LacZ的酶切产物分别与pAd5的酶切产物连接,构建了pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。2 Ad5-LacZ和Ad5-IL-29的制备及IL-29的表达鉴定通过脂质体法将pAd5-LacZ和pAd5-IL-29分别转染入293细胞中,共三次感染293细胞后,扩增、提取及纯化了Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,分别进行了滴度测定。Western Blot结果显示对照组没有相应的条带出现,而实验组中检测到分子量约23 kDa的特异蛋白条带,提示pAd5-IL-29构建成功,且IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌细胞株YES2中表达。3 Ad5-IL-29介导的抗增殖作用机制的初步研究3.1 Ad5-IL-29抑制不同食管癌细胞增殖的情况与Ad5-LacZ处理组相比,随着MOI的增高,Ad5-IL-29处理组中各细胞的增殖率均不同程度下降,而在TE1、TE10和YES6细胞中增殖率的变化差异无统计学意义(P0.05),在TE2、YES2和YES5细胞中增殖率的变化差异有统计学意义(P0.05)。在抑制细胞增殖方面,与Ad5-LacZ相比,Ad5-IL-29可抑制TE2、YES2和YES5细胞增殖,但在TE1、TE10和YES6细胞中未发现其抑制细胞增殖的作用。3.2 Ad5-IL-29对YES2细胞的细胞周期影响情况用流式细胞仪检测敏感细胞株YES2中细胞周期改变情况,结果显示,处理YES2细胞48 h后,实验组Ad5-IL-29与对照组Ad5-LacZ相比,sub-G1期和S期比例均出现不同程度增高(P0.05)。结论:1可构建pAd5-IL-29,IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌细胞株YES2中表达。2 Ad5-IL-29可抑制食管癌细胞增殖,但不同食管癌细胞株对其介导的抗增殖作用敏感性不同。在对其抗增殖作用敏感的食管癌细胞株中,其抗增殖作用的机制可能是细胞凋亡和细胞周期S期阻滞。
【图文】：

RT-PCR扩增IL-29基因片段电泳图

携带人白细胞介素29基因的5型腺病毒载体的构建及鉴定

pCR2.1-IL-29载体的构建及酶切鉴定Fig.2ConstructionofpCR2.1-IL-29andidentificationwithenzymedigestion
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.1;R450

【参考文献】