以Fba1和Hsp90为靶点的血清学检测及其对白色念珠菌病的诊断价值评估

发布时间：2020-05-29 13:32

【摘要】：念珠菌病感染是癌症、糖尿病、艾滋病和系统性红斑狼疮等危重病患者的并发症之一,其体内深部感染问题已经日益突出,成为危害病人死亡的重要病因。白色念珠菌(Candida albicans)通常存在于人的口腔、上呼吸道及阴道黏膜等部位。正常情况下,它与人体皮肤、粘膜表面的其它菌类达到平衡,不引起疾病。当真菌之间制衡失调时,白色念珠菌改变自身形态并大量繁殖,引起机体感染白色念珠菌。病人被白色念珠菌侵染初期症状不明显且不具有特异性,缺乏早期诊断的指标,往往错过最佳的治疗时间而导致死亡率上升,所以实现白色念珠菌感染的早期诊断至关重要。实验室常用的诊断方法有血培养法、组织病理性检查、直接镜检法等。目前血培养法被认为是临床上诊断的金标准,但它敏感性差、耗时长,往往延误最佳的治疗时机。组织病理性检查为创伤性检查,危重病患者难以承受。血清学检测法具有快速、简便、缩短检出时间的优势,弥补血培养法的不足,同时该方法还具有良好的灵敏性和不需要昂贵仪器的优点,是常用的实验室诊断方法。寻找理想的抗原标志物,可以达到提高血清学检测灵敏度的效果。目前作为诊断指标的抗原有甘露聚糖、烯醇化酶、(1,3)-β-D-葡聚糖、果糖二磷酸醛缩酶、热休克蛋白90等,筛选理想的诊断标志物对于提高白色念珠菌的诊断水平至关重要。本研究选用了两种诊断标志物果糖二磷酸醛缩酶1(Fba1)和热休克蛋白90(Hsp90)。Fba1出现在念珠菌细胞壁与胞浆内,在白色念珠菌呈菌丝相生长时,含量明显上调,说明Fba1与白色念珠菌侵袭生长相关,被认为是菌丝相特异性蛋白。Hsp90主要分布在胞浆,当机体被白色念珠菌感染时,Hsp90可以增加白色念珠菌的耐药性,调节白色念珠菌形态的变化、蛋白质的合成等,诱导细胞免疫反应。本文基于实验室前期的白色念珠菌检测研究基础,将噬菌体展示技术和血清检测学联合应用,旨在提高白色念珠菌检测的灵敏度。本研究主要包括以下2方面内容:1.白色念珠菌感染的诊断方法研究:选择两种免疫优势抗原Fba1和Hsp90,制备血清学检测试剂分别是Fba1重组蛋白(rFba1),在fd噬菌体pVIII端展示Fba1表位的单展示噬菌体F-phage,在fd噬菌体pIII端展示Hsp90表位的单展示噬菌体phage-H,同时在fd噬菌体pIII端和pVIII端展示Fba1表位和Hsp90表位的双展示噬菌体F-phage-H。2.检测试剂的抗原性鉴定:Fba1重组蛋白、F-phage、phage-H两种单展示噬菌体和F-phage-H双展示噬菌体均具有较好的抗原性,可以用于血清学检测。3.癌症患者的血清学诊断研究:利用上述制备的检测试剂对癌症患者血清进行间接ELISA检测,Fba1重组蛋白的阳性检出率略高于单展示噬菌体F-phage和phage-H,双展示噬菌体F-phage-H的阳性检出率最高,显著高于Fba1重组蛋白,可以通过联合展示检测标志物的方法提高噬菌体检测的灵敏度。本研究的意义:白色念珠菌感染临床上的早期特征不具有特异性,发现时可能会耽误最佳治疗时机。因此实现白色念珠菌感染的早期诊断对提高病人的治愈率和延长病人生命有重要的意义。血清学诊断是实验室常用的诊断方法,选择合适的标志物对血清学诊断效率的提高至关重要。目前,临床上尚无针对白色念珠菌检测的确定标志物。本研究联合噬菌体展示技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,缩短检出时间提高诊断的灵敏性,为实现临床上白色念珠菌感染的早期检测奠定一定的基础,减少癌症患者白色念珠菌感染的致死率。
【图文】：

模式图,丝状噬菌体,模式图,外壳蛋白

菌侵袭相关的蛋白，，可引起机体免疫反应[45, 46]。Mitsutake等白在念珠菌感染病人中的诊断价值[47]。二磷酸醛缩酶（1fructose-diphosphate aldolase，Fba1）分子量约的关键酶[48]。念珠菌的代谢过程中 Fba1 起到关键的作用。白时，Fba1 含量增加，说明它与白色念珠菌侵袭性生长相关[4抗原，可引发机体产生免疫反应[51]。究选用了两种与白色念珠菌侵袭相关的蛋白，果糖二磷酸和热休克蛋白 90（Hsp90）。菌体展示技术丝状噬菌体噬菌体包括 M13、f1、fd phage 等，本研究选用的是 fd 噬菌体生物材料，宽 7nm、长 900nm，含有 5 种外壳蛋白[52]。pV背部，有 2700 个拷贝，展示的外壳蛋白数量不受限制。pII只能展示 5 个外壳蛋白，特异性强。

模式图,多肽片段,噬菌体,模式图

4图 2 多肽片段展示在 pIII 端的单展示噬菌体模式图2.3.2 pVIII 展示系统pVIII 是 fd 噬菌体的主要外壳蛋白，位于其背部，拷贝数目较多有。不能展示过大的多肽或蛋白，但展示数目不受限制。有辅助噬菌体参与时，可形成杂合噬菌体，此时可融合较长的多肽片段。特点：展示的拷贝多，抗原性好。图 3 多肽片段展示在 pVIII 端的单展示噬菌体模式图表 1 丝状噬菌体 pIII 展示系统与 pVIII 展示系统分析比较2.3.3 双展示系统同时在fd噬菌体的pIII和pVIII端展示不同的外源多肽，构建双展示噬菌体。图 4 两种不同外源多肽同时展示在 pIII 端和 pVIII 端的双展示噬菌体模式图
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.1;R519.3

【参考文献】