消退素D1在小鼠脓毒症相关性脑病中的保护作用及机制研究

发布时间：2020-06-11 22:37

【摘要】：研究目的脓毒症(Sepsis)是临床常见的由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),可导致肝、肾、脑、肺等器官损伤,甚至诱发多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),常常危及生命。脑在脓毒症的发展进程中发挥着关键作用,既参与和调控免疫反应,又是病理过程中的受累器官。继发于脓毒症的弥漫性脑功能障碍被称为脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy,SAE),临床上多表现为意识错乱、焦虑、谵妄、昏迷等神经系统症状以及远期的认知功能损伤,是导致重症监护病房(Intensive care unit,ICU)中危重患者死亡的重要原因之一。SAE的发病机制尚不明确,可能与内皮细胞激活、血脑屏障损伤、神经炎症、脑内神经递质改变等多种因素有关。其中,由小胶质细胞介导的脑组织炎症与SAE的发生密切相关。研究显示,抑制小胶质细胞激活可减轻脓毒症小鼠脑内炎症反应及氧化应激损伤,并可改善小鼠的远期认知功能。消退素(Resolvins)是一种内源性促炎症消退脂质介质,其中?-3脂肪酸二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)的代谢产物消退素D1(Resolvin D1,Rv D1)在急性肺损伤、病理性疼痛、急性肾损伤、急性胰腺炎等多种动物疾病模型中都表现出了显著的促炎症消退作用。文献报道,Rv D1可提高脓毒症小鼠的生存率并减轻其肺组织的炎症反应。然而,关于Rv D1是否对SAE小鼠也具有保护作用尚无报道。本研究的目的是通过构建SAE小鼠疾病模型,探究Rv D1是否可减轻其炎症反应、改善临床症状,并初步探索小胶质细胞在其中发挥的作用及潜在机制。研究方法1.构建SAE小鼠模型取6-8周雄性C57BL/6小鼠,通过盲肠结扎穿孔法(Cecal ligation and puncture,CLP)构建脓毒症小鼠模型,根据Morris水迷宫实验(Morris water mazing,MWM)结果确认建模后小鼠出现认知功能改变;取小鼠海马组织进行IBA-1免疫组织化学染色并分析结果,观察建模后小鼠海马区小胶质细胞的数量与特点,并与假手术组进行对比。2.探究Rv D1对SAE小鼠认知功能的改善作用在构建SAE小鼠模型前对其进行连续5天的水迷宫训练。将训练后的小鼠随机分为三组:假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)和Rv D1处理组(CLP+Rv D1组)。CLP+Rv D1组于CLP术后立即给予100ng Rv D1尾静脉注射,Sham组与CLP组则给予等量0.9%生理盐水。于术后第2天开始进行Morris水迷宫实验并记录相关数据。3.探究Rv D1对SAE小鼠炎症的抑制作用(1)观察RvD1剂量对其抑炎作用的影响将6-8周雄性C57BL/6小鼠,随机分为五组:假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)和三种不同剂量的Rv D1处理组(CLP+Rv D1 1ng/只;CLP+Rv D1 10ng/只;CLP+Rv D1 100ng/只)。Rv D1处理组于CLP术后立即给予相应剂量的Rv D1于尾静脉注射,Sham组与CLP组则给予等量0.9%生理盐水。术后24h,收集小鼠外周血并检测血清中的炎症因子水平。(2)探究Rv D1对SAE小鼠外周血及海马组织中炎症因子水平的影响将6-8周雄性C57BL/6小鼠,随机分为三组:假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)和Rv D1处理组(CLP+Rv D1组)。CLP+Rv D1组于CLP术后立即给予100ng Rv D1于尾静脉注射,Sham组与CLP组则给予等量0.9%生理盐水。术后24h,收集小鼠外周血及海马组织检测其炎症因子水平。4.探究小胶质细胞在Rv D1保护SAE小鼠中的作用(1)观察Rv D1对SAE小鼠海马区小胶质细胞免疫组化染色的影响将6-8周雄性C57BL/6小鼠,随机分为三组:假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)和Rv D1处理组(CLP+Rv D1组)。CLP+Rv D1组于CLP术后立即给予100ng Rv D1于尾静脉注射,Sham组与CLP组则给予等量0.9%生理盐水。术后24h,收集小鼠海马组织进行IBA-1免疫组织化学染色并分析结果。(2)探究Rv D1对小胶质细胞炎症反应的抑制作用利用BV2细胞建立小胶质细胞体外刺激模型,将细胞分为对照组(Control组),脂多糖刺激(Lipopolysaccharide,LPS)组(LPS组)和Rv D1处理组(LPS+Rv D1组)。Rv D1处理组于细胞加入LPS刺激后即刻加入100n M Rv D1。培养24h后检测细胞炎症因子浓度及蛋白表达水平。研究结果1.Rv D1改善SAE小鼠认知功能Morris水迷宫实验结果显示:在隐蔽站台实验中,自术后第2天起,CLP组(57.4±1.5s)与Sham组(46.4±2.2s)相比潜伏期显著延长(P0.01),并持续至术后第5天;而术后第3天起,CLP+Rv D1组(49.8±0.8s)与CLP组(54.4±1.3s)相比潜伏期缩短(P0.05)。在术后第5天的空间探索实验中,CLP组较Sham组穿台次数显著减少(CLP vs Sham,0.8±0.4次vs 2.6±0.2次,P0.01)、目标象限活动时间缩短(CLP vs Sham,35.4±1.6s vs 44.2±3.2s,P0.05);而与CLP组相比,CLP+Rv D1组穿台次数增加(CLP vs CLP+Rv D1,0.8±0.4次vs 1.8±0.2次,P0.05)、目标象限活动时间显著增加(CLP vs CLP+Rv D1,35.4±1.6s vs 43±1.4s,P0.01)。2.Rv D1抑制SAE小鼠外周血及海马组织中的炎症反应在ELISA实验中,与Sham组相比,CLP组外周血与海马组织匀浆中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度显著升高(P0.05);而给予SAE小鼠100ng Rv D1后,CLP+Rv D1组与CLP组相比,上述炎症因子浓度降低(P0.05)。RT-PCR实验结果显示,在小鼠的海马组织中上述炎症因子在m RNA水平上也出现了相同的改变。与CLP组相比,Rv D1处理组的小鼠外周血中炎症因子出现不同程度的减少,且TNF-α、IL-1β和IL-6水平随Rv D1剂量的升高而呈现依次下降趋势。在Rv D1剂量为100ng/只时,TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度显著低于对照组(P0.05)。3.Rv D1抑制SAE小鼠海马区小胶质细胞激活通过对小鼠海马组织进行IBA-1免疫组化染色,我们发现:与Sham组相比,CLP组小胶质细胞活化数量显著增多(CLP vs Sham,37.6±4.3 vs 18.2±3.4,P0.05),且激活状态明显,其细胞突起回缩、胞体增大;而CLP+Rv D1组(22.7±4.1)则较CLP组(37.6±4.3)小胶质细胞数量减少(P0.05),且激活状态不明显。4.Rv D1抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应在体外实验中,LPS组细胞培养上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6浓度显著高于对照组(P0.05);而与LPS组相比,LPS+Rv D1组中上述炎症因子显著减少(P0.05)。Western blot实验结果显示,LPS组ERK、JNK、p38及NF-?B p65等蛋白质的磷酸化水平显著高于对照组(P0.05);而LPS+Rv D1组BV2细胞中上述蛋白的磷酸化水平显著低于LPS组(P0.05)。结论消退素D1对患有脓毒症相关性脑病的小鼠具有保护作用,可减轻其外周血及海马组织的炎症反应并改善小鼠的认知功能。这种保护作用可能与消退素D1能够抑制小胶质细胞激活并通过降低ERK、JNK、p38和NF-?B p65等蛋白质的磷酸化水平抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的产生有关。我们的研究发现了消退素D1在脓毒症相关性脑病中的功能及其机制,为脓毒症相关性脑病的治疗提供了新的药物靶点。
【图文】：

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图 2 水迷宫隐蔽站台实验中各组小鼠潜伏期与平均运动速度的比较A：各组小鼠在隐蔽站台实验中潜伏期比较；B：各组小鼠在隐蔽站台实验中平均运动速度比较。*P＜0.05，CLP 组 vs Sham 组；#P＜0.05，CLP 组 vs CLP+RvD1 组。在最后一次的隐蔽站台实验中，由各组小鼠典型运动轨迹图可明显观察到，与Sham 组相比，CLP 组寻找隐蔽站台的路程远，潜伏期延长（CLP 组 vs Sham 组，52.6±2.1vs 35.8±1.9s，P＜0.01）；而 CLP+RvD1 组较 CLP 组路程近，潜伏期缩短（CLP 组 vsCLP+RvD1 组，52.6±2.1 vs 43.4±1.9s，，P＜0.05）。（见图 3）

站台,小鼠,运动轨迹,平均运动

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