蛋清sIgE抗体光激化学发光分子诊断方法的建立及应用

发布时间：2020-06-28 15:40

【摘要】：目的:过敏原sIgE抗体的准确定量对食物过敏的诊断、治疗有着指导性意义;同时,过敏原分子诊断也逐渐成为趋势,在精准检测和精准脱敏中体现了重要价值。本研究以蛋清中的四种过敏原为具体实例,希望建立一种均相化学发光免疫分析方法用于检测血清中的sIgE抗体;同时,从分子诊断的角度出发,分析单个过敏原组分在评估蛋清过敏中的临床价值。方法:1.蛋清sIgE抗体光激化学发光方法的初步建立:基于光激化学发光(LICA)平台,以生物素标记四种过敏原,以抗人IgE抗体包被发光微球,与血清样本共同孵育;然后加入链霉亲和素包被的感光微球,构成整个反应体系。优化各试剂的最佳工作浓度及孵育时间,初步建立蛋清sIgE抗体分子诊断方法。2.蛋清sIgE抗体光激化学发光方法的性能验证:对初步建立的方法进行分析性能评估,如灵敏度、精密度、准确度等。并从70例蛋清过敏的患者中挑选出8例对单组分过敏的患者,与ImmunoCAP做相关性分析,进而验证该方法的准确性。3.蛋清过敏原分子诊断的临床价值评估:选择70例过敏患者和30例健康对照,以ImmunoCAP方法为标准,做受试者工作曲线,计算灵敏度、特异度及曲线下面积,分析单一过敏原组分在评估过敏中的临床价值。并将四组分两两组合进行研究,选择具有最佳诊断价值的组合方式。结果:1.蛋清sIgE抗体光激化学发光方法的初步建立:将血清稀释倍数、过敏原浓度、抗人IgE抗体浓度、发光微球浓度及第一阶段孵育时间进行优化,最终确定最佳血清稀释倍数1:10、过敏原浓度0.665μg/ml、抗人IgE抗体浓度1μg/ml、发光微球浓度20μg/ml、第一阶段孵育时间30 min为最佳工作条件。2.蛋清sIgE抗体光激化学发光方法的性能验证:用该方法检测蛋清四种过敏原,其批内及批间精密度(变异系数)分别为1.83~4.13%和2.70%~8.70%;在将阳性血清高倍比例稀释时,检测结果与阴性血清依然能区分开来,表明该方法的灵敏度良好;在准确度试验(稀释试验)中,其回收率为90.29~117.93%;同样,对单组分过敏的患者进行检测,该方法与ImmunoCAP相关性良好(r~2=0.929)。3.蛋清过敏原分子诊断的临床价值评估:蛋清过敏原卵类黏蛋白(Gal d 1)和卵白蛋白(Gal d 2)在评估蛋清过敏中有同样的价值,曲线下面积(AUC)均为0.81,特异度分别为90.0%和93.3%,灵敏度较低,分别为61.4%和58.6%。但是,当把Gal d 1和Gal d 2联合应用分析时,灵敏度可以达到72.4%。结论:本研究基于过敏原分子诊断,建立了检测蛋清sIgE抗体的光激化学发光分析方法。该方法具有较好的分析性能,有一定的临床应用价值,有望在食物过敏分子诊断领域发挥更大的作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.6
【图文】：

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图 1 LICA 检测血清 sIgE 的原理图Figure 1 Principle of LICA for the determination of sIgE in human sera.研究目的本文基于光激化学发光（LICA）平台，建立一种新型血清 sIgE 抗体体外检测方法，以蛋清中四种主要过敏原：卵类黏蛋白（OM，Gal d 1）、卵白蛋白（OA，Gal d 2）、卵转铁蛋白（OT，Gal d 3）、溶菌酶（Gal d 4）[21]为具体实例，对食物过敏原 sIgE 抗体进行分子诊断。同时，分析单个过敏原组分在评估蛋清过敏中的临床价值。研究方法1.基于光激化学发光（LICA）平台，将血清样本与生物素标记的蛋清四种过敏原、抗人 IgE 抗体包被的发光微球、链霉亲和素包被的感光微球共同孵育，构成整个反应体系。优化最佳工作浓度及工作时间，初步建立蛋清 sIgE 抗体的 LICA检测方法。2.对初步建立的方法进行分析性能验证，如灵敏度、精密度、准确度。并

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天津医科大学硕士学位论文对象和方法系，其原理如图 2 所示。用稀释液配制成不同浓度的标准品溶液：0，0.003，0.013，0.054，0.217，0.435 IU/ml，形成 hIgE 浓度-信号值强度的剂量曲线。然后，由hIgE 浓度推理获得 sIgE 的浓度[23]，得到 sIgE-信号值强度的剂量曲线，其横坐标浓度单位为 IU/ml。选取 8 例只对单一组分过敏的患者血清并检测，根据这 8 例血清 ImmunoCAP 的检测结果将剂量反应曲线的横坐标校准为浓度单位 kUA/L，最终得到 sIgE 定量的剂量-反应曲线。在定标过程中，每次检测均做复孔。制备的标准品溶液分装后于-20℃保存备用。

【参考文献】