幼年大鼠放射性脑损伤的实验研究

发布时间：2020-06-28 17:56

【摘要】：研究背景随着儿童肿瘤研究的深入和医学技术水平的发展,目前儿童肿瘤的五年生存率高达80%,而放疗是治疗原发性或转移性颅内肿瘤及涉及中枢神经系统的白血病和淋巴瘤的有效措施之一。但放疗在有效的治疗脑部肿瘤的同时也存在着多种短期和长期的不良反应,如认知障碍、内分泌异常及代谢紊乱等。这些不良反应对患者的生活质量造成重大影响,已经成为目前肿瘤治疗效果评估中仅次于生存率的重要衡量指标。目前尚缺乏针对放疗并发症的有效预防或治疗策略。照射后损伤的大脑区域主要包括以下三方面:1.小脑:小脑被认为主要与运动功能相关,在保持身体平衡和运动协调方面发挥重要作用。但目前越来越多的证据显示小脑和认知功能间同样存在着重要联系,颅脑照射可以引起显著的小脑蚓部损伤,导致认知功能障碍。2.下丘脑:临床回顾分析中显示高达80%的幼年期颅脑照射的癌症幸存者存在着下丘脑-垂体轴功能障碍和代谢并发症,其发病机制或作用途径仍不清楚,临床MRI检测显示下丘脑体积在幼年期照射后会出现明显减少。3.海马:针对动物海马及室管膜下区照射会导致认知与行为功能障碍,我们的研究显示在照射后海马区域存在大量的神经干细胞死亡,临床相关研究也显示海马照射和认知缺陷间存在关联性。因此,本研究将针对以上三个脑区进行放射性脑损伤的实验研究。最新研究认为照射并发症发生的分子机制主要包括氧化应激、神经干/组细胞死亡、神经炎症和神经血管损伤等。1.照射诱导的氧化应激会引发多种细胞反应,包括细胞死亡等;2.神经干/组细胞因其特殊的细胞周期类型及放射敏感性,是放疗引起的主要死亡细胞类型,研究证实神经干/组细胞在照射后死亡主要是通过凋亡相关途径进行,我们之前的研究也证实减少颅脑照射诱导的神经干/组细胞凋亡,可以有效改善认知功能障碍;3.颅脑照射可以引起大脑急性和慢性炎症反应,主要以细胞因子改变、小胶质细胞活化以及T细胞浸润为特征,是导致干细胞功能障碍和持续性脑损伤的重要原因;4.血脑屏障异常是照射引起大脑损伤的另一个重要原因,主要通过血管内皮细胞死亡及增殖减少来显著改变血管内皮细胞密度,导致血脑屏障通透性增加和结构异常。作为治疗双向情感障碍疾病的原型药物-锂已经被证实具有神经保护作用,可以减少凋亡诱导的神经干/组细胞死亡、拮抗谷氨酸兴奋性毒性和减轻成年大脑模型中的短暂性脑缺血发作,同时在小鼠颅脑照射前应用锂也显示出对认知损伤的改善作用。尽管锂用做治疗双向情感障碍疾病的药物已有十多年,且在分子、细胞及行为水平上都已证实了它的效果,但锂对放射性脑损伤的长期影响以及全身效应,作用机制和潜在毒性目前仍不是特别清楚。综上所述,我们将使用幼年啮齿动物颅脑放射模型研究照射引起的短期和长期脑损伤,探讨颅脑照射引起的常见认知障碍、代谢及内分泌紊乱等并发症的发病机制,探索新的预防和治疗药物,为临床干预和治疗儿童肿瘤放疗并发症提供理论依据和新的策略。第一部分幼年大鼠颅脑照射对小脑的影响目的颅后窝肿瘤是儿童颅内肿瘤最常见的类型,放疗是目前最有效的治疗方法之一,但是颅内照射在有效的治疗肿瘤的同时也会引起小脑的损伤,进而造成短期和长期的不良反应,对患者的生存质量产生显著的影响,该研究的目的是探讨幼年大鼠颅脑照射后小脑的病理改变及相关机制。方法采用新生11天雄性Wistar大鼠,随机分为照射组和对照组,照射组接受单一剂量6 Gy全脑照射,所有动物在照射前给予腹腔5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)注射,对照射后不同时间点小脑区域新生细胞死亡、增殖和分化进行检测,同时检测小脑区域炎症因子和趋化因子含量、小胶质细胞激活及血脑屏障改变情况等。结果1.颅脑照射诱导的细胞死亡主要集中在小脑外颗粒层(EGL)区域,同时外颗粒层细胞增殖减少,其中82.9%的新生细胞在照射后24小时内死亡。2.颅脑照射引起氧化应激反应,小脑区域出现小胶质细胞聚集和炎症反应增加。3.与其它脑区相比,颅脑照射引起小脑部位血脑屏障损伤和血流减少更为明显。4.颅脑照射后16周,小脑体积减少39%,新生细胞向内颗粒层迁移减少87.5%。结论颅脑照射导致小脑区域出现持续的炎症和损伤,因此,临床上进行儿童肿瘤照射治疗时应考虑小脑对照射的敏感性,进一步探讨新的保护策略。第二部分幼年大鼠颅脑照射对下丘脑的影响目的采用新生11日龄大鼠,通过给予6 Gy全脑照射构建幼年期颅脑照射模型,探讨颅脑照射对代谢的影响,探索可的能作用机制。方法采用新生11天雌性Wistar大鼠,随机分为照射组和对照组,照射组接受单一剂量6 Gy全脑照射。观察照射后代谢的相关变化,同时通过免疫组化、转录组分析、q PCR和Elisa等技术手段研究下丘脑、脂肪和肝脏等代谢相关部位或器官的变化。结果1.照射后下丘脑区域出现神经细胞死亡、小胶质细胞激活和长期的星形胶质细胞增值,转录组分析显示代谢相关通路发生显著改变。2.颅脑照射组大鼠15周开始出现体重、BMI和腹围都显著高于对照组,同时照射组出现空腹胰岛素水平增加、胰岛素抵抗和口服糖耐量异常,血清甘油三酯水平明显升高等代谢改变。3.颅脑照射组皮下白色脂肪组织、肠系膜白色脂肪组织和性腺白色脂肪组织重量均明显增加,同时免疫组化染色显示白色脂肪组织细胞肥大增生。结论对未成熟脑照射会导致下丘脑损伤和迟发性代谢紊乱,考虑到下丘脑区域在颅脑照射中的易损性,在临床进行颅脑照射应考虑对下丘脑区域的保护策略。第三部分幼年大鼠颅脑照射对海马的影响及锂的保护作用目的颅脑照射是治疗原发性、转移性脑肿瘤及涉及中枢神经系统的白血病及淋巴瘤的最有效方法之一。但是颅脑照射常导致延迟性和进行性的认知障碍,而且缺乏有效的预防和治疗手段。本研究旨在探索颅脑照射对海马区域的影响和锂的神经保护作用。方法采用新生11天雄性Wistar大鼠,接受单一剂量6 Gy全脑照射。在照射前后给予腹腔注射锂盐进行干预,对照组给予生理盐水应用,检测照射后海马区域细胞死亡及增殖情况,以及照射后的长期行为学改变及对内分泌激素的影响。结果1.锂治疗可以有效减少19.8%照射引起的海马齿状回颗粒下层神经干细胞死亡,同时锂治疗后的海马区存活的Brd U阳性细胞总数相比生理盐水处理组高50.1%。2.锂治疗减少了照射后60天大鼠在旷场中心区域停留的时间,改善了大鼠焦虑行为,同时物体识别测试显示照射诱导大鼠的记忆功能显著下降,锂治疗可以有效的改善这种缺陷。3.锂治疗可以恢复照射导致的迟发性促甲状腺激素和生长激素水平降低,并减少照射损伤引起的脑源性神经营养因子增加。4.最重要的是,当锂浓度超过12.8m M时,肿瘤细胞的存活率急剧下降,而对神经干/祖细胞的影响不明显。在耐照射的肿瘤DAOY细胞系中,10Mm的锂能增加肿瘤细胞对照射的敏感性。结论颅脑照射引起海马神经细胞死亡、干细胞增殖减少及迟发性的垂体功能减退症,锂治疗在没有不良反应的同时有效的减轻了这一系列脑损伤情况,提示锂治疗可以防治放射引起的脑损伤。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.55
【图文】：

颅脑照射,小脑皮质,外颗粒层,小脑

第一部分幼年大鼠颅脑照射对小脑的影响结果1 颅脑照射导致小脑皮质外颗粒层细胞死亡TUNEL 染色检测小脑区域的神经细胞死亡情况（图 1.1A细胞主要集中在小脑皮质外颗粒层（EGL）（图 1.1A，右图）。与相比，照射后 6 小时和 24 小时 TUNEL 标记的死亡细胞总数均在照射后 6 小时差异最大（图 1.1B）。基于 H＆E 染色切片，与射后 6 小时大鼠小脑 EGL 的体积增加 20.8％，而在 24 小时后EGL 体积反而减少 52.9％（图 1.1C）。通过免疫印迹确定小脑激活（图 1.1D），与照射后 24 小时相比，照射后 6 小时半胱天3）的 17kDa 降解产物定量显示 caspase-3 活性增强（图 1.1E ）。3 活性检测进一步证实了免疫印迹结果（图 1.1F）

模式图,颅脑照射,小脑

小时与对照组相比小脑区域 BrdU 阳性细胞数降低了 82.9％（图1.2C）。通过 BrdU 和 TUNEL 双染色（图 1.2D）定位新生细胞的凋亡情况，进一步通过共焦显微镜进行定量分析，结果显示在对照组中荧光双染色细胞数目较少，而在照射后 6 小时和 24 小时绝大多数 BrdU 阳性染色的细胞同时也显示 TUNEL染色阳性，这表明在照射组中存在大量的新生细胞凋亡情况（图 1.2C,E）。图 1.2 颅脑照射导致小脑新生细胞死亡。（A）幼年期大鼠小脑中的细胞层的代表性染色图片和模式图。（B）在小脑的 EGL 中代表性的 BrdU 染色。（C）BrdU 阳性细胞的定量结果显示在 6 小时照射组和对照组间没有差异，但是照射后 24 小时的 BrdU 阳性细胞数量减少了 82.9％。（D）在小脑的 EGL 中代表性 BrdU 和 TUNEL 双染色图片。（E）BrdU 和 TUNEL 双阳性细胞的共聚焦定量分析。对照组 n = 4，照射组 n = 6。EGL：皮质外颗粒层;ML：分子层;PCL：浦肯野细胞层;IGL：皮质内颗粒层;WM：白质。***P<0.001。3 颅脑照射后小脑小胶质细胞的激活和炎症反应Iba1 标记的细胞（标记全部激活和未激活的小胶质细胞）均匀地分布在整个2 颅脑照射后小脑新生细胞增殖和死亡

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