【摘要】：蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)是巯基氧化还原酶,属于硫氧还原蛋白超家族。PDI的结构中主要包含两个酶催化活性域a、a’,其活性位点为CGHC;两个底物结合域b、b’以及C末端的内质网驻留信号KDEL。PDI主要存在于内质网(endoplasmic reticulum,ER)上是蛋白质折叠所需的氧化还原酶。PDI的表达变化或者酶活性的失调与一系列的疾病相关,如神经退行性疾病和心血管疾病。除了作为可溶性氧化还原酶存在于内质网中,PDI也存在于细胞外侧,PDI可以分泌或转运到细胞表面,细胞膜表面的PDI参与调节多种重要的生理过程,包括血小板活化、血栓形成、T细胞迁移及骨质瘤迁移等。疼痛是由躯体感觉神经元外周突触末梢感受各种伤害性刺激(温度刺激、机械刺激和化学刺激等),并将其转化为神经冲动向中枢传递,而引起的痛感觉。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告,引起机体一系列防御性保护反应。躯体感觉神经元的胞体在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),其神经末梢数量庞大支配各种周围组织包括皮肤、关节、呼吸道等。DRG神经元作为躯体感觉初级传入神经元,在痛觉信号传导过程中发挥着极其重要的作用。有研究发现DRG神经元不仅具有痛觉信号形成和传递作用,而且还兼具痛觉信号调节作用。另外有研究发现在疼痛模型中背根神经节DRG和脊髓中的PDI表达升高,使用PDI抑制剂可以使小鼠的痛阈值升高,缓解小鼠的疼痛症状。我们的前期研究也发现,特异性敲除DRG组织Nav1.8阳性神经元上的PDI可以缓解由缓激肽(BK)诱发的小鼠急性炎性疼痛症状。为了进一步证实PDI与疼痛的关联,本论文旨在探究PDI在背根神经节DRG组织中的特征性分布和分泌情况,以及PDI蛋白在慢性疼痛中的变化及其发挥的作用。第一部分PDI在小鼠背根神经节DRG的分布及其对小鼠急性疼痛行为的影响目的:分析背根神经节DRG中PDI的分布特性及分泌情况,同时探究外源性给予PDI对小鼠疼痛行为的影响。方法:(1)使用冰冻切片和免疫荧光技术观察PDI与DRG组织相关Marker基因如IB4,CGRP,NF200的共表达情况。(2)应用ELISA试剂盒检测DRG组织PDI的分泌情况。(3)应用流式细胞术检测DRG神经元表面PDI的存在。(4)制备重组蛋白二硫键异构酶hPDI和突变蛋白PDIoooo。应用SDS-PAGE方法检测重组蛋白的纯度。以Di-E-GSSG为底物检测重组蛋白的还原活性。(5)将hPDI和PDIoooo分别注射到野生型小鼠的右后脚掌,观察注射前和注射后第1、3、5、24h,小鼠对热刺激和机械刺激的反应阈值。结果:(1)通过免疫荧光方法,我们观察到PDI与IB4,CGRP,NF200阳性DRG神经元均有一定程度的共定位。其中神经丝蛋白(NF200)用来标记大直径DRG神经元;降钙素基因相关肽(CGRP)是特异性表达在肽类小细胞神经元上的分子标记物;植物凝集素(IB4)是非肽类小细胞神经元的分子标记物。我们的实验结果提示PDI在DRG大、中、小神经元中均有表达。(2)应用ELISA试剂盒检测DRG组织PDI的分泌情况。从实验结果中可以看出DRG组织可以分泌PDI,与对照组(普通DRG外液刺激)相比,High K~+和BK的刺激没有使PDI的分泌量增加或者降低。(3)应用流式细胞术检测DRG神经元表面的PDI。从实验结果中可以看出DRG神经元表面确有PDI的存在,High K~+刺激没有改变神经元表面PDI的含量,阳性细胞率和平均荧光强度与对照组(普通DRG外液刺激)相比均没有显著性差异。(4)重组蛋白二硫键异构酶hPDI和PDIoooo的制备、纯度及活性检测。体外扩增大肠杆菌制备重组蛋白hPDI和PDIoooo,浓度分别为7.50mg/ml和8.22 mg/ml;SDS-PAGE检测hPDI和PDIoooo纯度分别为90%和85%;hPDI有较强的还原活性而突变蛋白PDIoooo基本没有活性。(5)重组蛋白PDI对小鼠行为学的影响。行为学结果显示,与注射PDIoooo的对照组小鼠相比,注射hPDI后使小鼠的热刺痛阈值明显降低,并且呈现明显的组间差异,尤其在第3h和第5h对热刺激变得更敏感与对照组相比有统计学差异。而注射hPDI的小鼠在第5h和第24h对机械刺激变得更敏感与对照组相比有统计学差异,但组间比较与对照组无明显组间差异。结论:以上实验结果表明:1.PDI在DRG各类神经元中均有高表达;2.PDI可以分泌到DRG神经元外;3.外源给予PDI可诱发小鼠的疼痛过敏行为(尤其是热痛过敏)。第二部分慢性疼痛模型中DRG中PDI的表达变化及其对小鼠疼痛行为的影响目的:研究DRG中PDI蛋白在小鼠慢性炎性疼痛及慢性神经病理性疼痛中变化情况及其在慢性疼痛中发挥的作用。方法:(1)制备CFA慢性炎性疼痛模型并检测DRG中PDI蛋白变化:实验组小鼠(野生型小鼠)后脚掌注射CFA(25μl),对照组小鼠注射生理盐水(25μl)。注射后第3、5、7天提取小鼠L3、L4和L5的DRG,进行Western-Blot实验,检测PDI蛋白的变化情况。(2)制备CCI慢性神经病理性疼痛模型并检测DRG中PDI蛋白变化:实验组小鼠(野生型小鼠)用羊肠线结扎坐骨神经,假手术组小鼠只进行平行手术,但不结扎坐骨神经。手术后第5、7、10天提取小鼠L3、L4和L5的DRG,进行Western-Blot实验,检测PDI蛋白的变化情况。(3)使用SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠制备CFA慢性炎性疼痛模型,应用热刺痛仪和Von Frey纤维刺痛针,测定SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠(实验组)和PDI~(fl/fl)小鼠(对照组)在注射CFA前1天和注射后第1、3、5、7、9、11、13、15天的热刺痛阈值和机械刺痛阈值。(4)使用SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠制备CCI慢性神经病理性疼痛模型,应用热刺痛仪和Von Frey纤维刺痛针,测定SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠(实验组)和PDI~(fl/fl)小鼠(对照组)在CCI手术前1天和手术后第1、3、5、7、10、14天的热刺痛阈值和机械刺痛阈值。(5)完成Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠的繁殖和基因型鉴定后,小鼠8周龄时连续四天腹腔注射2 mg Tamoxifen诱导DRG神经元中PDI的条件性敲除,使用Western-Blot技术检测PDI的敲除效率。(6)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠(实验组)和PDI~(fl/fl)小鼠(对照组)的右后脚掌注射CFA(25μl)制备慢性炎性疼痛模型。应用热刺痛仪和Von Frey纤维刺痛针,测定Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠在给药前1天和给药后第1、3、5、7、10、14天的热刺痛阈值和机械刺痛阈值。结果:(1)在注射CFA后第3,5,7天野生型小鼠DRG组织中PDI蛋白表达上调,与生理盐水注射组DRG内PDI表达量比值分别为1.22±0.04、1.78±0.23和1.79±0.14,CFA组与生理盐水组相比具有统计学差异。(2)在CCI手术后第5,7,10天野生型小鼠DRG组织PDI蛋白表达上调,与假手术组DRG内PDI表达量比值分别为1.52±0.04、1.32±0.07和1.30±0.07,CCI组与假手术组相比具有统计学差异。(3)SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CFA模型中的行为学结果:SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在给药后第5、7、9、11、13天热刺痛阈值升高,与PDI~(fl/fl)小鼠相比有显著性差异,并且呈现明显的组间差异。而SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠只在第13天对机械刺激变得更敏感,与PDI~(fl/fl)小鼠相比有显著性差异,但组间比较无显著性差异。(4)SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CCI模型中的行为学结果:SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CCI手术后第7、10天热刺痛阈值升高,与PDI~(fl/fl)小鼠相比有显著性差异,并且呈现明显的组间差异。而SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠与PDI~(fl/fl)小鼠相比对机械刺痛阈值并无明显差异,组间比较也无显著性差异。(5)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)转基因小鼠的交配繁殖和基因型鉴定及敲除效率鉴定:将Advillin-CreERT2转基因小鼠与PDI~(fl/+)转基因小鼠交配得到Advillin-CreERT2,PDI~(fl/+)杂合子小鼠后,再与PDI~(fl/+)小鼠交配得到Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠。小鼠出生后两周,剪脚趾标记,剪鼠尾提取基因组DNA,通过PCR扩增和凝胶电泳检测目的DNA条带。Cre基因的目的条带约180 bp,PDI的WT条带约480 bp,PDI的Flox条带(插入loxP位点的目的条带)约550 bp。DRG神经元中PDI的敲除效率:Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠8周龄时连续四天腹腔注射2 mg Tamoxifen诱导PDI敲除,分离Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠的DRG提取蛋白,使用Western-Blot技术检测PDI的敲除效率。结果表明,与PDI~(fl/fl)小鼠相比Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠DRG组织PDI蛋白量略有降低。(6)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠在CFA模型中的行为学结果:在CFA慢性炎性疼痛模型中,Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠的热刺痛阈值有升高的趋势,但与PDI~(fl/fl)小鼠相比,没有显著性差异。两组小鼠的机械刺痛阈值也无显著性差异。结论:1.在CFA慢性炎性疼痛模型和CCI慢性神经病理疼痛模型中DRG组织PDI的蛋白表达量升高;2.DRG痛觉神经元特异性敲除PDI可以缓解小鼠慢性炎性疼痛症状及神经病理性疼痛症状。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R402
【图文】：
数据分析采用 SPSS 软件，统计方法为两样本 t 检验，t'检验，配对验和单因素重复测量方差分析，图像处理和排版采用 OriginPro 8 lustrator CS6 软件。结 果1.PDI 在背根神经节 DRG 的分布情况腹腔注射 1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，4%多聚甲醛心脏灌流，提取野小鼠 DRG 组织，制备冰冻切片，进行免疫荧光染色，共聚焦显微镜行观察。从实验结果中（Fig.1），我们观察到 PDI 分别与植物凝集素IB4）、降钙素基因相关肽（CGRP）以及神经丝蛋白（NF200）有很度的共表达。上述结果提示 PDI 在 DRG 大中小神经元中均有表达。
CGRP and NF200. Arrows indicate examples of co-localiza bars were labeled on the left in each panel2.PDI 在背根神经节 DRG 的分泌情况（1）ELISA 试剂盒检测 DRG 组织 PDI 的分泌情况将野生型小鼠颈椎脱臼处死，提取左右两侧 DRG 分别置于 DRG高 K+DRG 外液（CK+= 150mM）中，室温孵育 30 min，离心取上为样品溶液，使用 ELISA 试剂盒检测样品溶液中 PDI 的含量。取右两侧 DRG 分别置于 DRG 外液、BK（100 μM）溶液中，室温孵in，离心取上清液作为样品溶液，使用 ELISA 试剂盒检测样品溶DI 的含量。ELISA 结果显示高 K+（Fig.2A）和 BK（Fig.2B）的刺有使胞外 PDI 的含量发生改变（paired t-test，P > 0.05）。
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