【摘要】：目的:近年来白色念珠菌(Candida Albicans,CA)生物膜感染导致的耐药性日趋严重,研究表明生物膜的形成是该菌感染性、耐药性不断增强的重要因素。目前临床多是采用大剂量的抗真菌药物治疗此类感染,从而进一步增加了耐药性。而中药由于其抗菌谱广、抗菌作用明显以及不易产生耐药性等特点,已成为目前抗感染治疗的重要研究内容。故本研究拟选择中药黄连的主要活性成分盐酸小檗碱作为干预手段,通过分析该活性成分对白色念珠菌生物膜形成表型和关键基因表达的影响,初步探讨盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜的抑制作用及其分子机制,为临床选择盐酸小檗碱辅助用于白色念珠菌生物膜感染的预防和治疗提供前期实验依据。方法:1.通过微量稀释法测定盐酸小檗碱抑制白色念珠菌生长的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC);通过构建白色念珠菌体外生物膜模型,并采用XTT法作生物膜生长动力学评价、hochest染色法观察菌丝形成动态过程,明确本实验室条件下生物膜构建条件以及芽管/菌丝形成时间。2.通过XTT法和激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)技术检测高、中、低浓度(4MIC、MIC、1/4MIC)盐酸小檗碱干预下白色念珠菌生物膜膜内细胞代谢活性、生物膜微观形态和厚度的变化,研究盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。3.通过hochest染色法检测高、中、低浓度(4MIC、MIC、1/4MIC)盐酸小檗碱干预下白色念珠菌菌丝形成的变化,研究药物对白色念珠菌菌丝形成的抑制作用,并进一步验证菌丝相与生物膜形成之间的关系。4.采用RT-PCR技术检测高、中、低浓度(4MIC、MIC、1/4MIC)盐酸小檗碱对菌丝形成关键基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)表达的影响,研究基因、药物、菌丝以及生物膜形成之间的关系,探寻盐酸小檗碱抑制白色念珠菌生物膜形成的分子调节机制。结果:1.盐酸小檗碱对白色念珠菌标准菌株ATCC10231和临床菌株CA2119浮游菌具有明显的抑制作用,其MIC均为32μg/mL;成功构建体外生物膜模型,且确定了早期、中期和成熟期生物膜形成时间,分别为0-6h,6-24h和24-48h,芽管/菌丝形成时间在4-6h。2.对于ATCC10231和CA2119早期(4h、6h)生物膜:与对照组相比,128μg/mL和32μg/mL盐酸小檗碱可以明显抑制生物膜膜内细胞活性、破坏其微观形态结构以及降低生物膜厚度,差异有统计学意义(P0.05),但8μg/mL盐酸小檗碱仅对ATCC10231有明显的抑制作用,差异有统计学意义(P0.05),对CA2119无明显抑制作用;与4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL盐酸小檗碱抑制作用明显优于氟康唑,差异有统计学意义(P0.05),但32μg/mL盐酸小檗碱抑制作用不及氟康唑;并且与ATCC10231相比,128μg/mL和32μg/mL盐酸小檗碱对CA2119生物膜内细胞活性以及生物膜厚度的抑制率较ATCC10231低,表明盐酸小檗碱对ATCC10231的抑制效果优于CA2119;同时盐酸小檗碱对ATCC10231的6h早期生物膜较4h早期生物膜抑制效果更为显著,提示6h早期生物膜可能是盐酸小檗碱抑制细胞活性的适宜时间。3.对于ATCC10231和CA2119的酵母相细胞:与对照组相比,128μg/mL和32μg/mL盐酸小檗碱均能明显抑制白色念珠菌从酵母相到菌丝相的转化,其菌量减少,菌丝形成受阻,而8μg/mL盐酸小檗碱无明显抑制作用。4.对于ATCC10231早期生物膜:与对照组相比,128μg/mL和32μg/mL盐酸小檗碱均能明显抑制4h和6h早期生物膜菌丝形成关键基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表达,差异有统计学意义(P0.05),而8μg/mL盐酸小檗碱则无明显抑制作用。与4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL盐酸小檗碱对4h生物膜的抑制作用明显优于氟康唑,差异有统计学意义(P0.05)。对于CA2119早期生物膜:与对照组比,128μg/mL盐酸小檗碱可以抑制6h早期生物膜菌丝形成关键基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表达,差异有统计学意义(P0.05),32μg/mL和8μg/mL盐酸小檗碱可以抑制HWP1和ECE1的表达,差异有统计学意义(P0.05);但对4h早期生物膜,128μg/mL盐酸小檗碱无明显抑制作用,32μg/mL盐酸小檗碱可以抑制Efg1和ALS1的表达,而8μg/mL盐酸小檗碱可以抑制HWP1和ECE1的表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.高浓度与中浓度盐酸小檗碱可以通过杀灭生物膜膜内细胞、破坏生物膜完整结构从而抑制白色念珠菌生物膜的形成,其作用机制可能是通过下调菌丝形成关键基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表达,阻延白色念珠菌发生形态转化,影响生物膜形成关键物质-菌丝的形成实现的。2.盐酸小檗碱对临床菌株表型以及关键基因的表达具有一定的抑制效果,但抑制效果不及标准菌株,提示盐酸小檗碱对临床菌株的干预作用还存在许多问题,需要进一步扩大样本研究探讨,耐药性的产生可能会增强机体对其他抗真菌药物的抵抗性。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5
【图文】：
图 2-1 ATCC10231 生物膜细胞生长曲线 白色念珠菌芽管/菌丝形成动态过程实验用 hochest 染色法对培养 0-8h 的白色念珠菌进行染色，从而观察形成过程，结果见图 2-2。白色念珠菌在培养 2h 左右形成大量芽生孢
ATCC10231菌丝形成过程（荧光倒置显微镜，400倍×）
图 2-1 盐酸小檗碱对不同阶段盐酸小檗碱膜内细胞活性的抑制率A 表示与 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，a 表示与 ATCC10231 6h 生物膜相比，p<0.05与 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，b 表示与 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05，C 表示ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，c 表示与 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05.2 各药物干预组中白色念珠菌生物膜微观形态和厚度的变化
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 游雪娇;李良秋;马连营;彭斐元;;激光共聚焦扫描显微镜在抗菌机理研究中的应用[J];微生物学通报;2015年06期
2 万江帆;唐春萍;沈志滨;江涛;;中药单体联用抗真菌药物抗耐药白色念珠菌的研究现状[J];中国中药杂志;2014年01期
3 钟罗枫;王文丽;陈慧芝;彭苑霞;徐晖;詹若挺;陈蔚文;;紫檀芪对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用[J];广东药学院学报;2013年03期
4 杨梦琪;杨帆;;白色念珠菌生物膜的形成及其机制的研究进展[J];广东药学院学报;2012年05期
5 郑玉荣;刘涛峰;张虹亚;;中药成分抗白念珠菌的实验研究进展[J];中国中西医结合皮肤性病学杂志;2011年06期
6 阳隽;张天托;朱家馨;;卡泊芬净对生物膜态白色念珠菌体外抑菌作用的试验研究[J];中国药房;2011年33期
7 张莉;张永信;;抗真菌药物的开发历程与研究进展[J];上海医药;2011年07期
8 郜向娜;余加林;芦起;刘立婷;;四唑盐减低法结合激光共聚焦显微镜定量分析表皮葡萄球菌生物被膜体外模型[J];中国微生态学杂志;2010年12期
9 王丹敏;靳颖;董小青;刘丽英;;白色念珠菌生物膜生长动力学分析和形态学观察[J];武警医学院学报;2010年09期
10 王聪;白丽;;真菌生物膜研究进展[J];中国病原生物学杂志;2010年03期
相关博士学位论文 前3条
1 许懿;小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究[D];第二军医大学;2010年
2 陈建宏;中药香莲外洗液对不同念珠菌株耐药性基因组学研究[D];广州中医药大学;2009年
3 权华;小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用及作用机制研究[D];第二军医大学;2006年
相关硕士学位论文 前3条
1 段万石;脂肪乳对中心静脉导管表面混合生物膜形成的影响[D];昆明医科大学;2016年
2 王晓明;桂皮醛、丹皮酚对根管内白色念珠菌抑菌效果的实验研究[D];河北医科大学;2015年
3 王彩瑞;4种中药提取物体外抗白色念珠菌的敏感性研究[D];大连医科大学;2010年
本文编号：
2762900
本文链接：https://www.wllwen.com/linchuangyixuelunwen/2762900.html
