RNA结合蛋白QKI调控单核巨噬细胞极化及抗感染机制研究

发布时间：2020-07-25 19:06

【摘要】：脓毒症(Sepsis)是由细菌或病毒等病原体感染引起的全身系统性炎症,伴随着器官损伤,衰竭,甚至死亡。由于其发病机制复杂,传统的抗生素和液体治疗等临床治疗方式具有局限性,脓毒症的死亡率仍居高不下。探究脓毒症发病机制、寻求新的治疗策略具有十分重要的理论价值和临床意义。受到病原体感染时,巨噬细胞作为机体固有免疫系统的卫士,可以通过吞噬、杀伤及分泌细胞因子等方式清除病原菌。巨噬细胞具有可塑性,在免疫微环境中它可以极化成两个功能截然不同的亚群:促炎M1型和抗炎M2型。它们在受体,细胞因子及功能方面差异很大。在炎症早期,以M1为主发挥促炎功能,分泌IL-6、TNF-α等细胞因子;募集并激活适应性免疫细胞。急性炎症后期,巨噬细胞转为M2型拮抗炎症,通过分泌IL-10、TGF-β,促进炎症消融;促进组织修复及伤口愈合。这种巨噬细胞的亚型转变引起炎症期-消融期的过渡,受到精密、准确的调控。巨噬细胞的极化调控异常与感染导致脓毒症进程密切相关。因此,极化的巨噬细胞和信号通路已经成为疾病治疗的靶点。RNA结合蛋白QKI(quaking),通过参与RNA的剪接,翻译等过程调节RNA的转录后调控。我们前期发现QKI参与单核巨噬细胞分化过程的调控,但是对巨噬细胞极化调控的分子机制尚不清楚。为了进一步阐明QKI是否参与巨噬细胞极化方向调节,我们从细胞、动物水平进行一系列实验。主要发现如下:1)QKI的表达水平和巨噬细胞的极化亚型相关。通过体外构建巨噬细胞极化模型,我们发现,M1型巨噬细胞中,QKI表达降低。相反,在M2诱导条件下,QKI的表达升高。2)通过分别构建QKI干涉和过表达的稳转细胞系,我们发现QKI参与调控巨噬细胞的极化过程。在M1极化条件下,干涉QKI的巨噬细胞M1型相关促炎标志分子iNOS,TNF-α和IL-6的表达显著上调,而抗炎因子如IL-10,Fizz1,Chil3或Ym1等表达下调。有意思的是,即使在M1诱导条件下,过表达QKI也会促使巨噬细胞M1型促炎因子下调,而M2型标志分子则上调表达。3)机制研究发现,QKI能够上调芳基烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,Ahr)的表达和信号转导和转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)的磷酸化,从而抑制NF-κB的转录活性。此外,QKI还能够抑制NLRP3炎性小体的活化,进而抑制IL-1β的分泌,而这一过程也依赖于Ahr。4)体内构建LPS诱导的小鼠脓毒症模型发现,髓系特异敲除QKI小鼠的死亡率和血清促炎性因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的表达显著高于对照组;反之,向髓系特异敲除QKI小鼠注射过表达QKI的巨噬细胞则能够显著改善小鼠生存率,同时小鼠促炎性因子IL-6,TNF-α和IL-1β显著下调,抗炎细胞因子IL-10水平升高;检测小鼠腹腔巨噬细胞,M2型巨噬细胞的比例显著升高。5)总之,我们的研究表明QKI能够通过Ahr/STAT1-NF-κB通路调控巨噬极化,抑制过度的炎症反应,进而影响脓毒症的进展。本研究揭示了巨噬细胞极化的新机制,拓展了QKI的生物学功能,同时也为将QKI作为一个潜在靶点研发脓毒症治疗药物提供了一定的理论基础和实验基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
【图文】：

羧基末端,细胞核,细胞质,核定位

图 1.1 QKI 分子结构示意图利用针对每个羧基末端特异性的抗体，Hardy 研究小组发现，在小鼠脑中，所三种不同亚型的 QKI 均在胶质细胞中表达。但是三者存在的区域有差别，QKI-要存在于细胞核内，而 QKI-6 和 QKI-7 主要表达在细胞质中。对于他们存在位置差异性，部分研究发现，这与他们差异的羧基末端有关。虽然没有经典的核定位号（Nuclear localization signal ，NLS)，但是 QKI-5 的 30 个氨基酸的尾巴与其核位和转移相关。另外在小鼠胚胎中发现了神经祖细胞分化成的神经胶质细胞中QKI-5 由细胞核重新回到了到细胞质。因此事实上，QKI-5 可能穿梭在细胞核和细质中起作用。1) QKI 的相关功能RNA 结合蛋白 QKI 是控制中枢系统髓鞘发育的重要调控蛋白，参与心血管系的早期发育。QKI 蛋白调节几个信号传导途径以及功能。QKI 蛋白含有多个富含

结合位点,识别元件

图 1.2 QKI 的结合位点 X 射线对结合到 RNA 的 QKI STAR 域的结构进行分析。QKI 的 KHA2 区域以协同作用方式结合 RNA 识别元件的糖-磷酸骨架上。由 QUA的同源二聚体可以同时识别两个 RNA 识别元件。QUA2 的存在区域增殊性，QUA2 区域的存在增加了识别的特殊性，可以识别 4 至 6 个核 KH 结构域）。这些研究结果表明，QKI 将 RNA 作为二聚体和双向序QKI 在调控 RNA 代谢的几个方面中的作用性剪接：QKI 作为一种反式作用因子，通过结合裂解反应元件（QRE剪接。QKI 与其 QRE 的结合可能导致外显子跳过或者翻译。 RNA 生产：由于非典型形式的选择性剪接而发生环形 RNA 形成，QK circRNA 的外显子的 QRE 的结合可介导 circRNA 形成。RNA 加工：QKI 调节 miRNA 的机制之一是通过与 pri-microRNA 中的

巨噬细胞,表达水平,极化相关,刺激条件

结果3.1 QKI 表达水平与巨噬细胞极化相关为了确定 QKI 是否参与巨噬细胞极化，我们首先在 M1（LPS）或 M2（加 IL-13）刺激 16 小时后分析小鼠腹膜巨噬细胞中的 QKI 蛋白表达。如图所示，在 LPS 刺激条件下 QKI 蛋白质表达降低，在 IL-4 加 IL-13 刺激下表达水平升高。检测 QKI mRNA 表达使用 QKI5，QKI6 和 QKI7 的共同序物。在 RAW 264.7 细胞中，在 M1 巨噬细胞极化下 QKI 的 mRNA 表达先24 小时后逐步恢复到初始水平，然后在 48 小时再次升高。然而，在 M2 极件下，QKI 表达在 48 小时后增加了两倍以上（图 1B）。这些结果表明 QKI与巨噬细胞极化状态密切相关，可能参与巨噬细胞极化。

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