基于双荧光等温DNA扩增技术的HPV检测方法研究

发布时间：2020-07-30 02:10

【摘要】：目的:本研究拟整合等温DNA扩增技术和微流控芯片技术的特色与优势,建立一种适合于基层及欠发达地区医疗卫生机构的HPV分型方法,为HPV筛查及进一步研究HPV病毒载量与宫颈病变的关系提供新的工具。方法:1.双荧光等温多自配引发扩增(IMSA)法检测HPV16、52型。1)针对HPV16E7和HPV52E6基因序列各设计6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60 min,在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合染料作为反应指示剂,以反应最终荧光颜色变化作为结果判断标准。2)利用该方法对系列稀释的HPV16和HPV52质粒进行灵敏度分析。3)用已知单重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的临床标本进行特异性分析。4)用已建立的等温多自配引发扩增(IMSA)技术与103例宫颈刮片临床标本进行比对验证。2.一种可用于HPV16型精确定量的数字LAMP微流控芯片。1)在PCR管中对HPV16进行双荧光环介导等温扩增(LAMP)反应,并分析其灵敏度和特异性。2)应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,制作了一种新型的可用于核酸精确定量的数字等温微流控芯片(60 mm′40 mm′4 mm)。3)建立适合数字微流控芯片的双荧光LAMP反应体系。4)观察数字LAMP微流控芯片自吸式进样流程。5)用已知单重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的临床标本验证数字LAMP的特异性。6)用数字LAMP微流控芯片对浓度为6×10~-44 pg/μL的HPV16质粒DNA进行精确定量。结果:1.340μM HNB与1:10000 SYBR Green I混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455 nm蓝光激发下发生扩增的反应管双荧光显色为黄绿色,未发生扩增的反应管为橘红色;该方法对HPV16、52型检测限分别达到了60拷贝/反应和600拷贝/反应;可特异性检出样品中HPV16和HPV52;与临床检测结果比对无差异。2.在PCR管中双荧光LAMP对HPV16型的检测限为4×10~-44 pg/μL,并可特异性检出HPV16;制作的微流控芯片可实现自吸分液式进样,并可实现对HPV16型数字LAMP检测,150μM HNB与1:10000 SYBR Green I混合构建的双荧光指示剂在数字LAMP微流控芯片的微反应小室内具有明确的指示效果,455 nm蓝光激发下发生扩增的微反应小室双荧光显色为黄绿色,未发生扩增的微反应小室为橘红色;数字LAMP微流控芯片可实现HPV16型的精确定量,对浓度为6×10~-44 pg/μL的HPV16质粒DNA进行精确定量其浓度为163 copies/μL,并可特异性检出HPV16型。结论:1.本研究建立的HPV16、52型等温多自配引发扩增检测方法可用于HPV分型快速筛查,实现更简易明确的结果判读,适合基层医疗机构开展HPV基因筛查。2.本研究成功构建了可用于数字LAMP检测的微流控芯片,芯片满足数字化检测的各项需求,并且无需外接动力系统和微阀门,该芯片能够实现高危HPV16型的快速精确定量检测,并且特异性良好。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440
【图文】：

荧光光谱,双荧光,指示系统,去核

（A）120 μM HNB; (B)340 μM HNB; (C)420 μM HNB; 阳性反应：IMSA 对 1.2×104拷贝HPV52 质粒 DNA 分子扩增；阴性反应：IMSA 对去核酸酶无菌水(代替 DNA 模板)扩增图 2-1 不同浓度 HNB 与 1：10000 SYBR GreenⅠ组成的双荧光 IMSA 指示系统荧光光谱和双荧光显色图

序列,质粒,序列,单晶硅片

图 1-1 HPV16 质粒目的基因序列Figure .1-1 The plasmids with target gene sequence of HPV161.2 常用试剂与耗材SU8-2025，SU8-2075 购自美国 Micro Chem 公司；单晶硅片购自浙江开化县

微流控芯片,通道层

微流控芯片的通道层设计

【参考文献】