基于类修饰DNA探针和免疫竞争法的RNA N~6-甲基腺苷电化学检测方法研究

发布时间：2020-08-07 13:57

【摘要】：目的:自RNA化学修饰发现以来,研究者陆续发现了超过150种RNA修饰。其中N~6-甲基腺苷(N~6-methyladenosine,m~6A),被证实是真核生物中含量最丰富的RNA化学修饰之一。生物体内不同水平的m~6A发挥着不同的生物学功能,而这些生物学功能的异常则是导致肿瘤和疾病的重要因素。由于m~6A不会改变其与T和U的碱基互补配对能力,因此不能用标准杂交或测序技术直接检测m~6A;此外,目前缺乏能有效区分m~6A和A的化学方法,且RNA不稳定化学处理过程中降解增多,导致m~6A检测技术的发展进一步受限;致使m~6A的确切生物学调控机制研究进展缓慢。因此,建立一种m~6A快速、准确检测方法对m~6A的研究有着重要意义。方法:本研究以抗m~6A抗体,既能识别RNA中的m~6A也能识别DNA中的m~6A为基础,建立了一种无标记且高特异的电化学免疫传感方法,用于RNA中m~6A的检测。首先,利用组氨酸标记的重组蛋白G(his-PG)将抗m~6A抗体定向固定于金电极表面,以提高抗原抗体结合效率;其次,以合成的类修饰DNA探针(L1)作为信号分子与m~6A-RNA竞争性结合抗m~6A抗体,以拓宽新方法的检测范围;然后,用核糖核酸酶(RNase A)水解与抗体结合的m~6A-RNA,以消除m~6A-RNA长度及碱基序列对检测结果造成的影响,提高准确度。最后,通过检测免疫传感器的电阻抗谱(EIS)信号,实现对RNA中m~6A的检测。结果:在最优的实验条件下,所构建的电化学免疫传感器具有较高的灵敏度和特异性。由于竞争机制的存在,该方法的线性范围较非竞争法有大幅增加,为0.05~200 nM;检测限低至0.016 nM(S/N=3)。此外,该免疫传感器成功实现了对HepG2、L02、HBE和A549细胞系总RNA中m~6A的检测。结论:本研究通过his-PG将抗m~6A抗体定向固定于金电极表面,不仅提高抗原抗体结合效率,而且也保证了每个抗体都能被抗原所饱和,提高方法的重复性。利用类修饰DNA探针作为信号分子与m~6A-RNA竞争结合抗m~6A抗体以扩大线性范围。同时利用RNase A的水解作用,消除了不同长度RNA和碱基序列对检测造成的干扰。在最优的实验条件下,实现了对不同细胞系来源的总RNA中m~6A的检测,证明所构建的电化学免疫传感器,具备准确检测生物样本来源的RNA中m~6A含量的潜力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6;TP212
【图文】：

示意图,原理,示意图,抗体

重庆医科大学硕士研究生学位论文his-PG 的组氨酸标签与金电极表面牢固结合，形成 PG 的定向层。PG 识别抗体的可结晶片段区域（Fc），促使抗体定向固定于金电极表面，从而将抗体的结合位点暴露于环境中，更有利于抗原抗体的结合[44]。其次，利用L1与样品中的m6A-RNA竞争性结合抗体。然后，引入RNase A水解掉与抗体结合的m6A-RNA，将 m6A-RNA的检测转变为对 m6A-DNA 的检测，通过检测电化学免疫传感器的 EIS 信号，实现样品中 m6A-RNA 的检测。在该体系中，竞争性反应将大大拓宽免疫传感器的检测范围[45]，而 RNase A 的采用将消除由于 m6A-RNA 长度和碱基序列的不同对检测结果造成的干扰，提高检测准确度。

形貌,表征图,原子力显微镜

大小与 RNA 样本中 m6A 的含量成反比。2 结果与讨论2.1 电极表征2.1.1 原子力显微镜表征原子力显微镜（AFM）是分辨电极表面形貌变化的一种直观有效的方法。图1A 展示的是金电极表面固定了 his-PG 后的形貌图。当抗-m6A -抗体与 his-PG 结合后，电极表面出现了许多类似驼峰状的结构，该结构的形状与 IgG 类抗体的“Y”字形一致，说明 his-PG 能够将抗 m6A 抗体固定在金电极表面（图 1B）。同时，所有的抗体都是朝上均匀一致的排列，提示 his-PG 能够对抗体进行定向固定。然后，在电极表面加上 m6A-DNA（L1）后，形貌图中出现了许多丝带状的结构（图 1C），这与单链 DNA 的结构形态相符，证明抗 m6A 抗体能够特异性捕获 m6A。因此

曲线,电化学表征,免疫传感器,电流信号

针 L1（图 2A-f）后，带负电的探针和[Fe(CN)6]之间的静电排斥，使电流信号继续降低。最后，用 RNase A 水解掉电极上的探针 P1，由于静电斥力的消失，电流信号相比于曲线 e 回升（曲线 g）。以上结果，证实该电化学免疫传感器的制备是可行的。

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