Disabled-2通过经典Wnt通路下调LIG4增敏肺癌放疗

发布时间：2020-08-10 23:22

【摘要】：目的:Disabled-2(简称Dab2),是一种可负向调控Wnt信号通路的多功能衔接蛋白。先前研究发现Dab2在肺癌中表达下调,并与肺癌的进展和不良预后正相关,转染Dab2可以明显抑制肺癌细胞中Wnt通路的活性。DNA连接酶Ⅳ(简称LIG4),在大肠癌中作为Wnt通路靶基因,主要参与DNA损伤后非同源末端连接(NHEJ)修复。因此,我们猜测Dab2是否可通过Wnt/β-catenin信号通路下调LIG4的表达,进而抑制肺癌细胞的DNA双链断裂(DSB)后的损伤修复能力,从而增加肺癌细胞的放疗敏感性。研究方法:免疫组织化学染色检测了103例肺癌组织标本Dab2和LIG4的表达,并分析两者表达的关系及其与临床病理因素和患者预后的关系。构建野生型Dab2及突变型Dab2质粒(Dab2-PTB和Dab2-ΔPTB),并利用Dab2 siRNA,Wnt通路抑制剂iCRT-14和LIG4抑制剂SCR7,双向调控Dab2的表达和Wnt通路的活性。通过Western Blot检测Dab2,Wnt通路因子,LIG4及磷酸化γ-H2AX表达情况,用免疫荧光观察磷酸化γ-H2AX焦点数以判断X-ray照射后DNA的损伤修复情况,采用克隆形成实验、基质胶侵袭实验判断肺癌细胞照射后放疗增敏的情况。结果:免疫组化表明Dab2低表达(及LIG4高表达)与肺癌的低分化、高TNM分期、淋巴结转移及不良预后呈正相关。Western Blot结果显示经X-ray照射后,过表达Dab2和Dab2-PTB下调Wnt通路关键分子β-catenin,下调下游靶基因cyclinD1,MMP-7及LIG4的表达(P0.05),促进磷酸化γ-H2AX表达上调(P0.05);而转染Dab2-ΔPTB则上述因子没有明显变化。应用siRNA敲除A549中Dab2的表达后,明显上调了β-catenin、cyclinD1、MMP-7和LIG4的表达,而磷酸化γ-H2AX表达下调(P0.05),这种变化在联合应用iCRT-14被明显逆转(P0.05)。克隆形成实验及Transwell侵袭实验表明,在H1299细胞中转染野生型Dab2和突变体Dab2-PTB,经X-ray照射后克隆形成率明显下调,而转染Dab2-ΔPTB则无明显变化。经siRNA和X-ray处理后的A549细胞,克隆形成率和细胞侵袭数下调不明显,而联合应用iCRT14和SCR7后,均出现了明显的下调(P0.05)。结论:Dab2的低表达(LIG4的高表达)与肺癌的进展和患者的不良预后正相关;Dab2通过负向调控Wnt通路下调其靶基因LIG4的表达,抑制DNA损伤修复能力增敏肺癌放疗,Dab2基因可能成为临床增敏肺癌放疗的潜在靶点。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R734.2;R730.55
【图文】：

结构功能

这是临床工作中亟待解决的问题。众所周知，Wnt 信号传导通路是一些复杂生物进程的关键调节器，如胚胎育、干细胞维持、组织内稳态，甚至与肿瘤发生有关[7-9]。Wnt 作为肿瘤微环境的重要信使，主要通过经典 Wnt 通路参与肿瘤的发生发展[10]。与此同时，Wnt 路可以通过促进 DNA 损伤修复和抑制凋亡，增强肿瘤细胞对电离辐射的抵抗能[7]。根据相关报道，我们发现许多肿瘤细胞的放射敏感性是通过解除 Wnt 信号调节而增强的，包括胶质母细胞瘤[11]、结直肠癌[12,13]、乳腺癌[14]、鼻咽癌[15]、管癌[16]、肺癌[17]、肝癌[18]和头颈部肿瘤[19]等。因此，抑制 Wnt 信号可能是靶向疗的重要途径之一。Disabled-2（以下简称 Dab2）是哺乳动物/果蝇缺失基因家族的一员[20]，是个多功能衔接蛋白,包括三个功能区（图 1）：C 端脯氨酸结合区（PRD）、N 磷酸酪氨酸结合区（PTB）和磷酸作用区（PID）[21],参与 Wnt/β-catenin 通路等种信号传导通路。我们前期的研究结果表明，Dab2 主要通过 PTB 结构域与 Ax竞争性结合，促进β-catenin 的降解，抑制 Wnt 通路[22,23]。

过表达,肺癌,灰度值,肺癌细胞

结果显示肺癌细胞系中 Dab2 的蛋白表达水平均低于 HBE 细胞（图3A-B）,我们选取 H1299 和 A549 细胞系进行后续实验，Western Blot 证实了pcDNA-HA-Dab2 或 Dab2-siRNA 的转染效率（图 3C，F）。X-ray 照射前后的MTT 实验结果显示，相较于非照射组，过表达 Dab2 的照射组可显著抑制 H1299细胞的增殖（图 3D-E），然而，敲除 Dab2 的表达后，肺癌细胞对 X-ray 照射却

剪切体,转染,经典,灰度值

12图 4 Dab2 通过经典 Wnt 通路下调 LIG4 表达A-B：在 H1299 细胞中转染 Dab2-WT 及其剪切体质粒（Dab2-ΔPTB、Dab2-PTB），WB检测 Wnt 通路蛋白及其 LIG4 的表达及灰度值统计。C-D：H1299 中过表达 Dab2 并加入 Gsk-3β抑制剂 Tideglusib（25μM/ml）作用 24 小时后，逆转了下调的趋势。E-F：敲除 A549 中 Dab2的表达，WB检测显示，明显上调了β-catenin及LIG4的表达，但加入 iCRT14抑制剂（50μM/ml）作用24 小时后抑制了 LIG4、cyclinD1、MMP7 的表达。*P<0.05,**P<0.01。

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