脑脊液分离鲍曼不动杆菌分子流行病学特征及体外转录组研究

发布时间：2020-08-23 10:27

【摘要】：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)已成为引起医疗相关性脑膜炎的重要革兰阴性菌,特别是在神经外科的手术病人中。碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的出现并在世界范围内快速播散及广泛流行,使得鲍曼不动杆菌脑膜炎治疗中可供选择的抗生素十分有限,同时许多药物难以透过血脑屏障,因此鲍曼不动杆菌脑膜炎的治疗成为临床面临的巨大难题。尽管目前已有大量鲍曼不动杆菌相关的分子流行病学调查,但菌株来源往往以呼吸道和血流为主,脑脊液分离菌株的分子流行病学特征研究仍然缺乏。脑脊液来源菌株和其他来源菌株之间的比较研究则更为少见。因此我们开展了本研究,在为鲍曼不动杆菌脑膜炎的临床治疗和防控提供有力依据的同时,探索不同分离来源菌株间是否存在遗传背景的差异,以便更加精准地治疗鲍曼不动杆菌引起的各种不同类型的感染。鲍曼不动杆菌在导致中枢神经系统感染时受到独特的脑脊液环境压力,其在脑脊液中的生长适应机制为鲍曼不动杆菌引起中枢神经系统感染的致病机制提供了线索,也为疾病的治疗提供了潜在靶点。本研究的第一章,通过收集上海及浙江多家医院在2013年4月-2016年11月间脑脊液来源的鲍曼不动杆菌菌株54株,以及同期分离的血流来源菌株21株,对其进行药物敏感性试验,脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE),全基因组测序,MLST和cgMLST分型以及泛基因组关联分析研究。研究结果显示脑脊液分离得到的鲍曼不动杆菌中94.4%是CRAB菌株,并且对美罗培南的MIC值均在32μg/mL以上。同时这些菌株对除外替加环素和多粘菌素的其他种类抗生素的耐药率也均在90%以上,有1/6左右的脑脊液分离株对替加环素不敏感。所有菌株目前对多粘菌素仍保持100%的敏感率。21株血流分离株在耐药表型上和脑脊液分离株无明显差异。纳入研究的所有54株脑脊液分离株可分为10个已知的ST型以及4个新ST型。ST195是最常见的ST型,占了脑脊液分离株菌株的35.2%(n=19)。ST195菌株在血流来源菌株中也占首位,其次为ST208。54株脑脊液分离鲍曼不动杆菌中有50株细菌属于国内流行的CC92克隆复合体。3株非CC92克隆复合体的菌株分离自神经外科病人,提示神经外科分离的鲍曼不动杆菌遗传背景更具多样性。blaOXA-23基因是脑脊液分离菌株中唯一检测到的获得性碳青霉烯酶耐药基因。除了鲍曼不动杆菌中常见的β内酰胺酶(ADC,TEM-1D等)外,还检测到3株脑脊液分离株携带编码CTX-M-55型的β-内酰胺酶基因,其中的2株还共同携带有磷霉素耐药基因fosA。PFGE的结果显示属于CC92克隆复合体的菌株具有高度的同源性。通过cgMLST分型,可观察到在研究期间多克隆来源的菌株在院内播散流行,导致鲍曼不动杆菌脑膜炎的发生。某些不同医院内脑脊液分离得到的鲍曼不动杆菌菌株间也具有高度相似的遗传背景,提示了鲍曼不动杆菌存在院际之间克隆传播的可能。脑脊液分离株和血流分离株之间遗传背景也高度相似,血流分离菌株在耐药表型、耐药基因分布、ST分型、PFGE聚类分析以及cgMLST分型及泛基因组关联分析中均未显示出和脑脊液来源的菌株有明显差异。另外我们还证实了 cgMLST分型较传统的PFGE和MLST分型方法具有更高的分辨率和准确性。本研究的第二章,从上一部分研究的脑脊液分离菌株中选择了一株最常见的ST195型菌株C25,在体外进行了该菌株人脑脊液中生长的全局转录组研究。研究显示,在脑脊液中生长时C25菌株中有1551个基因较其在LB肉汤培养基中生长时发生了差异表达(log2 | Fold change | ≥1,false discovery rate,FDR p≤0.001),大约占了 C25全基因组基因的2/5。其中有794个基因表达下调,757个基因表达上调。通过直系同源群COG富集分析显示发生表达下调的基因主要富集在COG分类中J类(翻译和核糖体功能)和U类(细胞内运输、分泌和囊泡运输)中。而表达上调的基因仅在S(未知功能类)和K(转录)两个分类中发生了富集。以上结果显示了在体外脑脊液环境中鲍曼不动杆菌C25的低生长和生物合成状态。一些已知的鲍曼不动杆菌毒力因子在脑脊液组中也发生差异表达。其中铁摄取相关基因,包括两组嗜铁素基因簇和血红素利用相关的基因簇表达上调;和生物被膜形成相关的AdeFGH外排泵和群体感应系统的abaI基因表达也有上调。针对铁合成和生物被膜形成相关通路可能可以作为鲍曼不动杆菌脑膜炎治疗的潜在靶点。而表达明显下调的基因主要集中在一些膜孔蛋白基因(ompA,ompW和carO)和部分脂多糖合成的基因以及荚膜生物合成基因中。以上变化反应了鲍曼不动杆菌在脑脊液乏铁环境下的独特适应性变化。荚膜,脂多糖以及外膜蛋白等细胞表面毒力因子的表达下调也反应了细菌在脑脊液环境中细胞膜生物合成受限。体外脑脊液环境并不利于鲍曼不动杆菌的生长。综上所述,本研究明确了华东地区5家医院脑脊液分离鲍曼不动杆菌的分子流行病特征,并利用cgMLST分型的方法明确了鲍曼不动杆菌在导致医疗相关性脑膜炎发生时多克隆来源菌株的院内感染传播模式。脑脊液分离菌株和同期血流感染分离菌株在遗传背景上无显著差异。同时我们首次进行了鲍曼不动杆菌临床菌株在体外人脑脊液中生长的转录组学研究,得到了其在体外人脑脊液中生长的全局转录组学特点和已知毒力因子基因的差异表达变化规律。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.9;R446.14
【图文】：

曼不动杆菌中５１株对美罗培南耐药，同时这５１株ＣＲＡＢ菌株对哌拉西林／他唑逡逑巴坦、头孢哌酮／舒巴坦、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢吡肟、四环素、庆大霉逡逑素的耐药率均在９０％以上（图１．邋１）。另外有１株脑脊液分离菌株对替加环素耐药逡逑（ＭＩＣ邋＝邋４ｎｇ／ｍＬ），９株为替加环素中介菌株，其余４４株对替加环素敏。所有脑逡逑脊液分离株对多粘菌素的敏感率为１００％。而同期血流分离菌株的抗生素敏感性试逡逑验和脑脊液组细菌相近（附表１．３）。逡逑值得注意的是，所有ＣＲＡＢ菌株的美罗培南ＭＩＣ值均在３２邋ｐｇ／ｍＬ以上，且逡逑超过三分之一的菌株的美罗培南ＭＩＣ值大于等于１２８邋ｐｇ／ｍＬ。另有３株脑脊液分逡逑离株和１株血液分离株对美罗培南敏感，它们对其他类别抗生素均保持良好的敏逡逑＿敏感■中介■耐药逡逑替加环索逡逑ＲＸ９９逦４６逦＿逡逑四环索Ｂｆｃｉ逦４９逡逑头孢毗肟Ｄｈ逦５０逦｜逡逑头ｍ他啶５0逦0逡逑左氧ｍ沙ｓ邋Ｅｌ逡逑关罗培南Ｄ逦５１逦0逡逑头孢哌酮／舒巴坦４９逦｜逡逑懪拉西林／他畦巴坦０逦５１逦０逡逑图１．１脑脊液分离鲍曼不动杆菌菌株药敏结果逡逑感性。逡逑１３逡逑

（ｈｔｔｐ：／／ｅｂｕｒｓｔ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ／）按照默认参数选项（７个管家基因中有６个一致并且菌株逡逑数目大于３为定义为一个克隆复合体ｃｌｏｎａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＣＣ）邋，邋５０个脑脊液分离菌逡逑株被划为一个克隆复合体（图１．２），其中２株是目前尚未定义的新ＳＴ型，均为逡逑ＳＴ５４０的单位点变异型（Ｓｉｎｇｌｅ邋ｌｏｃｕｓ邋ｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＶ），在本研究中将其命名为ＮＴ５４０．１逡逑１４逡逑

所有７５株细菌拼接完成的基因俎草图上传至ＣＧＥ网站（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ逡逑／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ－２．１／）利用ＲｅｓＦｉｎｅｒ数据库工具比对，菌株获得性耐药基因的分逡逑布可见图１．３。鲍曼不动杆菌产生碳青霉烯类抗生素耐药性的主要机制包括产碳青逡逑霉烯酶、膜孔蛋白突变、外排泵高表达等，其中以产Ｄ类碳青霉烯酶苯唑西林酶逡逑（ＯＸＡ型碳青霉烯酶）这一机制最为重要。基因是脑脊液分离株中所有逡逑ＣＲＡＢ菌株中唯一被检测到的获得性碳青霉烯酶耐药基因。其他常见的获得性逡逑ＯＸＡ型碳青霉博酶耐药基因如以及金属酶基逡逑因均未被检测到。在所有脑脊液分离株中均检测到定位于鲍曼不动杆菌染色体上逡逑的基因，其中以基因占绝大多数，和之前的文献报道一致，编逡逑码ＯＸＡ－６６型破青霉q婷傅木�株均属于欧洲克隆谱系ＩＩ邋（Ｅｕｒｏｐｅａｎ邋ｃｌｏｎａｌ邋ｌｉｎｅａｇｅｓ逡逑ＩＩ），也就是与之对应的ＣＣ９２克隆复合体［２９］。４株非ＣＣ９２克隆复合体的脑脊液逡逑分离株检测到了邋４种不同的Ｗｆｌｏｍ／如基因，分别编码ＯＸＡ－６４，ＯＸＡ－６７，ＯＸＡ－６８，逡逑ＯＸＡ－１２０型碳青霉烯酶。同时所有脑脊液菌株中均检测到在不动杆菌属中最常见逡逑的编码头孢菌素酶的基因ｔ３（）Ｉ。Ｗａｎ／Ｄ基因在３６株脑脊液分离株中被逡逑检测到。以上两种Ｐ－内酰胺酶基因的高表徶和鲍曼不动杆菌的舒巴坦耐药机制密切逡逑１５逡�

本文编号：2801411